今天给大家分享的就是一篇使用oxBS-seq技术对复杂疾病预后相关的潜在表观遗传标志物研究，该研究成果刚刚发表在Clinical & Translational Medicine期刊上。首先，先了解下oxBS-seq的技术原理和优势。
oxBS-Seq技术原理
传统的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC），而oxBS-Seq将5hmC氧化5fC，后者可以被Bisulfite转为U，从而实现5mC的精准检测；同时，经过与常规Bisulfite结果比较可以实现对5hmC的准确检测。该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。该方法非常适合用于需要对DNA甲基化和羟甲基化进行区分的研究测序分析。
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标题：An epigenomic landscape of cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer using single-base resolution methylome and hydroxymethylome（使用oxBS-seq方法对宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的表观遗传学研究）
主要结论：系统的描绘了从宫颈上皮内瘤变（CIN）进展为宫颈癌（CC）的甲基化和羟甲基化图谱，揭示了8个与CC预后相关的DNA甲基化/羟甲基化差异化基因，可以作为CC预后的表观遗传标志物。
发表时间：2021年7月19日
期刊：Clinical & Translational Medicine
影响因子：11.492
技术方法：WGBS-seq、oxWGBS-seq、RNA-seq
易基因承担了本研究测序与分析工作
01：研究背景
宫颈癌（CC）作为最常见的妇科肿瘤之一，发病率和死亡率居高不下。早期CC的5年生存率在90%以上，而晚期和转移性CC的5年生存率则明显下降。因此迫切需要进一步研究CC的发病机制，寻找潜在的生物标志物，研究和开发新的诊断技术和治疗方法。
有许多研究表明宫颈癌的发生和进展跟异常的表观遗传修饰相关，主要包括胞嘧啶甲基化（5mC）和羟甲基化（5hmC），通过5mC/5hmC对基因表达的表观遗传调控在肿瘤发生过程中起着关键作用。然而这些研究没有绘制完整的表观基因图谱，不能从健康宫颈到宫颈上皮内瘤变（CIN）再到宫颈癌（CC）整个发病机制中区分5mC和5hmC。另外通过多组学综合分析在宫颈癌中鉴定生物标志物的报道数量十分有限。
本文作者选择从健康宫颈到CIN到CC的一系列样本，进行全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS-seq)、oxWGBS-seq、RNA-seq 和组蛋白修饰数据进行综合分析，以确定CC特异性的潜在表观遗传生物标记物。
02：研究思路
采用oxBS-Seq方法绘制从健康宫颈到CIN到CC样本在单碱基分辨率下的全基因组5mC/5hmC图谱。
分析CC进展过程中差异甲基化区域（DMR）和差异羟甲基化区域（DhMR）变化趋势。
GO/KEGG富集分析与DMRs相关基因 (DAGs) 和DhMRs相关基因 (DhAGs)。
个性化分析DAGs和DhAGs甲基化和羟甲基化水平与基因表达的关系。
多组学综合分析甲基化/羟甲基化与基因组变异的相关性。
对甲基化/羟甲基化与组蛋白修饰关联分析。
03：研究结果
（1）从健康人群到CC，全基因组5mC和5hmC水平呈下降趋势
研究人员对2个健康宫颈组织、6个CIN组织（CIN1、CIN2、CIN3，n=2）、4对CC组织及对应的癌旁组织共16个样本中提取DNA进行WGBS-seq和oxWGBS-seq测序（oxBS-seq），共480-1480万个CpG位点可用于评估在碱基分辨率下的羟甲基化变化。在此基础上，研究人员在单碱基分辨率下绘制了从健康宫颈到CIN到CC样本的全基因组5mC/5hmC图谱，并绘制了CpG位点的5mC/5hmC修饰图谱。
结果显示， 16个样本中，从健康宫颈到CC，5mC和5hmC水平均呈下降趋势（图1A）；且所有患者的5hmC水平比5mC水平低43倍（图1B）；5mC修饰位点中有6.33%-24.63%的5hmC修饰，而健康宫颈中约有10%的5hmC修饰（图1C，蓝色标记），100%的5hmC修饰位点也同时被5mC修饰（图1C，黄色标记）。
图1
（2）5mC和5hmC含量分布
研究人员分析了5mC和5hmC修饰位点在各基因组区域的分布，结果显示，CC与对应的癌旁癌旁组织的整体甲基化水平相似，整体高于健康组织和CIN组织，而癌旁组织的整体羟甲基化水平高于CC组织（图2A）。
在CC中观察到整体低甲基化和低羟甲基化，特别是与健康组织相比，CC中差异甲基化区域（DMR）和差异羟甲基化区域（DhMR）数量增加。在CIN和CC组织中，甲基化和羟甲基化水平变化主要发生在CpG岛和 CpG周围区域，且在CIN和CC中观察到外显子甲基化（图 2B）。结果表明局部甲基化/羟甲基化变化可能极大促进宫颈癌发生。
图2
（3）CC发展过程中DMR和DhMR变化
与CIN1和CIN2相比，在CIN3和CC期DMR的数量增加，表明在CC发生过程中甲基化水平发生了变化。在CIN3期DhMR数量急剧增加，在CC期减少（图3A）。从DMRs和DhMRs在CC中的分布来看，CIN3发生高羟甲基化，CC发生低羟甲基化（图3B），表明在CC发展过程中表现了剧烈的去甲基化转变（图3B）。
图3
（4）与DMR和DhMR的相关基因
由于启动子甲基化主要促成基因表达，研究人员重点关注启动子区域的DMRs相关基因 (DAGs) 或 DhMRs相关基因 (DhAGs)，发现有几个甲基化基因（如NFIX、CDH4、PDE4D、PITX2和G6PD）（图4A左）和两个羟甲基化基因（PLSCR4、CUL4B）（图 4A右）可能与CC的发生发展有密切关系。
为了深入了解甲基化和羟甲基化的潜在生物学功能，通过GO和KEGG富集了DAGs和DhAGs。GO富集结果提示了与CIN和CC相关的生物过程（图4B）。KEGG富集结果显示，这些甲基化基因在Hippo、cAMP、Adherens连接、轴突导向和神经活性配体-受体相互作用中显著富集（均p<0.05）；羟甲基化基因也在Hippo、cAMP、Rap1、ErbB和MAPK信号通路中显著富集（图4C）（均p<0.05）。
图4
（5）DAGs和DhAGs甲基化和羟甲基化水平与基因表达的关系
将TCGA数据库中CC甲基化数据和成对RNA-seq数据进行分析对比，发现结果是一致的。
甲基化/羟甲基化水平与基因表达之间的关系：
启动子区域的甲基化水平与基因表达呈负相关（图5A）；
启动子边界的上调基因表达中观察到更高水平的甲基化；
外显子边界的甲基化水平和基因表达之间呈正相关趋势；
羟甲基化，则没有类似现象。
DAGs/DhAGs的甲基化或基因表达与总生存率之间的关系：
MTIF2、PIP5K1A和RPS6KA6的甲基化和表达均与在CC总生存率呈正相关；
DES和MAL的甲基化和表达与CC总生存率呈负相关（均p＜0.05 图5B和5C）；
ANGEL2、MPP1和PAPSS2的甲基化和表达不同，CC总生存率有显著差异。
因此这8个基因的甲基化水平可以作为预测CC预后的潜在生物标志。
图5
（6）甲基化/羟甲基化与基因组变异的多组学综合分析
作者比较了甲基化区域和基因拷贝数变异（copy number variations，CNVs）区域不匹配数据的位置，分析结果显示，SCNV扩增或缺失区域与全基因组DMR区域呈现不一致地重叠（图6A和6B）。比如CNV和DMR/DhMR在2号染色体上的位置不一致（图6C）。
经多组学综合分析验证，证实在CINs和CC中，CNV与甲基化/羟甲基化之间无明显相关性（图6D）。甲基化/羟甲基化的发生远早于CNV（图6A和6B），即宫颈癌变诊断中表观遗传改变比遗传改变发生得更早，这也表明甲基化/羟甲基化更适合作为CC早期预警标记。