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上次我们分享了：全基因组DNA甲基化实验怎么做：手把手教你做全基因组DNA甲基化测序分析，深受同学们的欢迎。
本期，易基因小编给您讲讲简化基因组DNA甲基化实验怎么做，从技术原理、建库测序流程、信息分析流程等三方面详细介绍。

一、  简化基因组DNA甲基化测序（RRBS）技术原理

简化基因组甲基化测序 (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS) 是通过限制性酶切的方法富集基因组DNA 上富含 CCGG 位点的片段，经 Bisulfite 处理和高通量测序技术进行基因组 CpG 富集区域内的单碱基分辨率的甲基化测序[3]。相对 WGBS 而言 RRBS 技术作为高性价比的甲基化测序方案， 其测序量大幅减少，在大规模临床样本研究中具有广泛的应用价值。

简化基因组甲基化测序利用重亚硫酸氢盐能够将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为胸腺嘧啶 （T）的特性，将基因组用重亚硫酸氢盐处理后测序，即可根据单个 C 位点上未转化为 C 未转化为 T 的 reads 数目与所有覆盖的 reads 数目的比例，计算得到甲基化率。该技术对于全面研究胚胎发育、衰老机制、疾病发生发展的表观遗传机制，以及筛选疾病相关的表观遗传学标记位点具有重要的应用价值。

简化基因组甲基化测序原理示意图如下：

二、简化基因组DNA甲基化测序（RRBS）技术流程

图1：RRBS工作流程

（一） DNA样品检测

对DNA样品的检测主要包括2种方法：

（1）Qubit对DNA浓度进行精确定量；

（2）琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有污染；

（二） 文库构建

（1）基因组 DNA 提取：根据不同的样品类型采用不同的提取方案，获取高质量的基因组 DNA。

（2）DNA 质量检测：Qubit 检测 DNA 样品浓度，琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 样品完整性。

（3）限制性酶切：通过酶切富集 CpG 片段。

（4）末端修复，加 A，甲基化接头连接：在 DNA 分子两端引入接头序列及 index 序列。

（5）选择 CpG 富集的 DNA 片段：电泳回收选择富含 CpG 的 250-500 bp 片段。

（6）Bisulfite 转化：回收的基因组 DNA，加入 lamda DNA（一种噬菌体 DNA，用于监测重亚硫酸盐测序的转化效率），随后通过 Bisulfite 处理将非甲基化碱基 C 转化成 U。

（7）PCR ：PCR 扩增富集文库及纯化PCR产物获得最终文库。

（三） 文库质检

文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度> 2nM），以保证文库质量。

（四） 上机测序

文库检测合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina Nova平台测序，测序策略为PE150。

三、简化基因组DNA甲基化测序（RRBS）信息分析流程

将测序结果与参考基因组比对，比对上唯一位置的序列用于后续标准信息分析及个性化分 析。信息分析流程如下：

图2：RRBS信息分析流程示意图

（一）测序数据质控和统计

1、数据产出与质控

测序完成后，对数据进行去除接头序列和低质量过滤，随后将过滤后的数据与参考基因组比对。数据过滤标准为：包含adapter 序列，序列中N 碱基的比例超过序列总长度的5%，序列中质量值小于 5 的碱基比例超过序列总长度的 50%，如果一条序列符合以上三个条件中的任何一个，则去除这条序列。

2、C 碱基有效测序深度的累积分布和覆盖度

以下图为示例，反映了 CpG，CHG 和 CHH 碱基有效测序深度的累积分布（基于有效数据计算）。其中横轴表示碱基有效测序深度，纵轴表示一定测序深度下碱基的覆盖度（占基因组总位点的比率）。

图3：CpG，CHG 和 CHH 碱基累积深度和覆盖度

（二）样品整体甲基化水平

1、全基因组甲基化水平

每一个甲基化 C 碱基的甲基化水平均按如下公式进行计算：C 位点的甲基化水平 = 100 * 支持甲基化的 reads / (支持甲基化的 reads + 支持非甲基化的 reads)。全基因组平均甲基化水平反应了基因组甲基化图谱的总体特征。以下图为示例，反映了样本的整体甲基化率分布， X 轴表示不同的甲基化率范围，Y 轴表示不同甲基化率范围内 C 位点数目的百分比。可以看出低甲基化C 位点比例较高。后续分析均采用 5X 以上 C 位点。

图4：C位点在不同甲基化率范围的百分比

2、全基因组C碱基的平均甲基化水平

不同分布类型的甲基化C 位点（mC）在不同物种基因组中出现比例不同，因此，各类型甲基化C 位点( mCG、mCHG 和 mCHH ) 的数目，及其在全部 mC 的位点中所占的比例 ( 例：mCHG 所占比例= mCHG 数目/mC 的总数 )，在一定程度上反映了特定物种的全基因组DNA 甲基化修饰特征。

图5：全基因组C 位点平均甲基化水平

 

3、全基因组三种类型甲基化位点的比例分布

计算全基因组中 CG, CHG 和 CHH 三种类型的甲基化位点的数量和比例。

图6：CG, CHG 和 CHH 三种类型的甲基化位点的数量和比例

 

4、染色体水平的甲基化和C碱基密度分布

从染色体水平来描述甲基化 C 碱基的的分布情况（仅>50M 的序列）。绿色细线表示以 10kb 的窗口统计甲基化 C 碱基的密度在染色体上的分布情况，光滑曲线则表示不同类型甲基化C 碱基( CG、CHG 和 CHH )的密度分布。

以下图为示例：

图7：染色体上甲基化 C 密度分布示例

说明：X 轴表示某染色体上碱基的位置，左Y 轴表示特定染色体碱基位置上 10kb 窗口内不同类型甲基化C 占该类型所有C 的比例（分为 CG、CHG、CHH，H 代表A 或者T），右 Y 轴表示特定染色体碱基位置上 10kb 窗口内甲基化C 的碱基密度（甲基化 C 数目占总碱基数目的比例）。为了区别CHH 与 CHG 曲线，已将 CHH 甲基化水平×50 倍放大绘出。

 

5、甲基化 C 位点附近的9bp序列的序列特征分析

分析CG和非CG位点的甲基化的C附近碱基的分布情况，统计不同甲基化模式出现的概率。下图为示例：

图8：CG 位点的甲基化C附近序列特征示例

说明：X 轴表示甲基化 C 碱基（CG、CHG 和 CHH）上下游4bp的位置，Y轴表示特定位置上A、T、C、G 四种碱基的权重值，权重值越高表示其比例越高。

6、分析CpG island 及其周边区域的甲基化水平分布规律

以下图为示例，反映了样本在 CpG island，CpG island shore（CpG island上下游2kb区域）和 CpG island shelf（CpG island 上下游 2000pb 至 4000bp）区域的甲基化水平分布情况。可以看出 CpG island 区域的甲基化水平整体较低，而 CpG island shore 的甲基化水平分布较均匀，更远离CpG island的CpG island shelf甲基化水平最高。

（三）不同组别样本的甲基化差异

1、CpG 甲基化相关性分析（PCC）

下图示例反映了样本之间 CpG 甲基化率的相关性，圆面积越大，颜色越深相关性越高。