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2022年06月23日，华南农业大学兽医学院向勇博士为第一作者、曹伟胜教授为通讯作者在《Veterinary Research》杂志发表" The expression level of chicken telomerase reverse transcriptase in tumors induced by ALV-J is positively correlated with methylation and mutation of its promoter region"的研究论文，该研究通过靶基因重亚硫酸盐测序（Target gene bisulfite sequencing,Target-BS）和Sanger测序，表明鸡端粒酶逆转录酶（Chicken telomerase reverse transcriptase ,chTERT）在禽白血病病毒J亚群（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）肿瘤中的过表达与其启动子的高甲基化和突变水平呈正相关。深圳市易基因科技有限公司提供本研究的chTERT靶基因DNA甲基化测序服务。
摘要
禽白血病病毒J亚群（ALV-J）可引起家禽肿瘤疾病，在中国广泛流行。鸡端粒酶逆转录酶（chTERT）与肿瘤发生发展密切相关。先前研究表明chTERT在ALV-J肿瘤中过表达，但其机制仍不完全清楚。本研究从启动子区域DNA甲基化和突变角度分析chTERT在ALV-J肿瘤中过表达的潜在分子机制。chTERT靶基因DNA甲基化（扩增子甲基化）测序显示ALV-J复制促进了cTERT启动子甲基化水平。ALV-J肿瘤中启动子区域chTERT甲基化水平显著高于肿瘤邻近组织和正常组织，与肿瘤邻近组织和正常组织相比，ALV-J肿瘤中的chTERT启动子-183bp C>T突变，36.0%的肿瘤-184 bp T>C基因突变，chTERT启动子-73 bp::GGCCC和-56bp A>T分别形成转录因子NFAT5、TFAP2A和ZEB1的结合位点。RT-qPCR和免疫印迹试验（Western blotting）结果表明，这些突变使chTERT表达水平显著上升。总之，本研究表明chTERT在ALV-J肿瘤中的过表达与其启动子的高甲基化和突变水平呈正相关，为进一步研究chTERT在ALV-J肿瘤发生中的分子机制提供了新视角。
材料方法
本研究以DF-1细胞和LMH细胞为体外模型，通过靶基因DNA甲基化测序和Sanger测序鉴定鸡肿瘤细胞和正常细胞chTERT启动子区域的甲基化水平和突变特征，并分析了ALV-J复制对chTERT基因启动子甲基化水平的影响。以ALV-J肿瘤组织、肿瘤邻近组织和正常组织为研究对象，研究ALV-J肿瘤中chTERT启动子区域甲基化水平和突变特征，并统计分析这些差异对chTERT表达的影响。
chTERT启动子甲基化预测
作者参考NCBI上chTERT启动子区和编码区相关序列，分析chTERT启动子区可能的甲基化CpG位点。结果发现起始密码子ATG上游600 bp至下游800 bp有2个CpG岛，包含110多个CpG位点。因此在本研究中，该序列被用作chTERT启动子区域DNA甲基化分析的靶基因，扩增子相对于chTERT编码区ATG起始密码子的位置为-627bp至+873bp。
图1： chTERT启动子区域DNA甲基化预测
靶基因重亚硫酸盐测序
从细胞和组织中提取DNA，在深圳市易基因科技有限公司进行靶基因重亚硫酸盐测序（Target-BS）。
表1：chTERT扩增子甲基化分析的BSP引物序列
研究图形
图2：LMH和DF-1细胞chTERT启动子DNA甲基化水平比较
图3：ALV-J复制促进DF-1细胞chTERT启动子区域甲基化
图4：ALV-J复制促进了LMH细胞中chTERT启动子区域甲基化
图5：LMH细胞和DF-1细胞chTERT扩增子DNA甲基化水平热图
图6：chTERT在ALV-J肿瘤和肿瘤邻近组织及正常组织中的DNA甲基化水平变化曲线
关于易基因靶基因DNA甲基化测序（Target-BS）
对目标基因/CpG 位点甲基化检测，建立灵活的靶向甲基化测序技术。易基因建立的靶基因甲基化高通量测序（Target Bisulfite sequencing，Target-BS）是针对已有目标基因panel组合，运用易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件，对亚硫酸盐转化后的目标基因多重扩增，建库后进行超高深度（1000X以上）甲基化精准检测。
应用方向：
Target-BS广泛用于已知位点的甲基化Biomarker筛选、验证及临床转化应用
Ø 后续目标基因的甲基化验证
技术优势：
Ø 多基因多重扩增，检测通量高；
Ø 超高深度亚硫酸盐甲基化测序，相对于传统BSP克隆测序，检测灵敏度、准确性高，可准确检测到样本中低于1%的甲基化水平；
Ø 样本需求量低，20ng基因组DNA可实现多基因扩增；
Ø 适用范围广，对基因组DNA、FFPE样本、游离cfDNA等样本均适用；
Ø 检测费用显著低于现有技术、快周期、超高性价比。
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因。
参考文献：Xiang Y, et al. The expression level of chicken telomerase reverse transcriptase in tumors induced by ALV-J is positively correlated with methylation and mutation of its promoter region. Vet Res. 2022 Jun 23;53(1):49.
