大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。
ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) 作为DNA调控元件百科全书整合了1w+个来自不同组织或细胞系的各类实验数据标准。以表观组学研究中的ChIP-seq为例，ENCODE Consortium使用不同的表观基因组分析，并制定对应的分析方案和指南，具有绝对的权威和参考意义。
本期，易基因小编为大家说明ENCODE数据库的组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq指标要求，包括测序分析概述、处理流程（Pipeline）指南和不同分析类型的数据标准。
组蛋白 ChIP-seq 数据标准和处理流程
（1）分析概述
ChIP-seq是一种用于分析蛋白质与DNA互作的方法。ChIP-seq将染色质免疫沉淀与DNA高通量测序相结合，以推断DNA相关蛋白的可能结合位点。ENCODE Consortium开发了两个分析pipeline来研究两种不同类别的蛋白质-染色质互作（组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq）。组蛋白ChIP-seq的pipeline适用于与较长区域或结构域上的DNA相关蛋白质。典型的靶点是组蛋白或特定的翻译后组蛋白修饰。
（2）处理流程
组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq的流程具有相同的比对步骤，但在信号和peak calling方法以及随后的重复样本统计处理方面有所不同。
组蛋白分析流程可以解析点状结合和更长的染色质结构域，这些结构域由许多靶蛋白或靶修饰实例结合。组蛋白ChIP-seq 流程的output适合作为将染色质区域分类为功能类别的染色质分割模型的input。
图1：具有生物学重复实验的组蛋白ChIP-seq分析流程
图2：没有生物学重复实验的组蛋白ChIP-seq分析流程
表1：组蛋白ChIP-seq分析流程的inputs
表2：组蛋白ChIP-seq分析流程的outputs
（3）流程指南
l 读长应至少为50个碱基对，鼓励更长的读长；分析流程可以处理低至25个碱基对的读长。可以配对或单端测序。
l 应注明使用的测序平台。不同的测序平台可能没有可比性。如HiSeq2000与HiSeq4000的重复不同，没有可比性。
l 生物学重复应在读长和运行类型方面相匹配。
l Pipeline文件比对到人（GRCh38）和鼠（mm10）序列。
（4）现行标准
l 实验应该有两个或多个生物学重复。由于实验材料的可用性有限，使用EN-TEx样品进行分析可以例外。
l 抗体必须根据ENCODE Consortium制定的标准进行鉴定。
l 每个ChIP-seq实验应该有相应的input控制实验，具有匹配的运行类型，读长和重复结构。
l 使用非冗余分数（NRF）和PCR瓶颈系数1和2，PBC1和PBC2衡量文库复杂性。优选值如下：NRF>0.9，PBC1>0.9，PBC2>10。
特定目标标准
l narrow-peak组蛋白实验，每个重复应该有不低于20M可用片段。
l broad-peak组蛋白实验，每个重复应该有不低于45M可用片段。
l H3K9me3是一个例外，因为它在基因组重复区域富集。与其他broad Marks相比，在组织和原代细胞中基因组的非重复区域中几乎没有H3K9me3 peaks。导致许多ChIP-seq reads比对到基因组中的非唯一位置。组织和原代细胞每个重复应该有不低于45M总比对 reads。
图3：特定目标标准
转录因子ChIP-seq 数据标准和处理流程
（1）分析概述
转录因子ChIP-seq (TF ChIP-seq) 处理流程适用于预测以点状方式结合的蛋白质，例如特定 DNA 序列或特定染色质结构。其中，IP标靶通常是已知或推定的转录因子或染色质重塑蛋白，也可以是 RNA 结合蛋白、其他 DNA 或染色质特异性因子。
（2）处理流程
组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq的流程具有相同的比对步骤，但在信号和peak calling方法以及随后的重复统计处理方面有所不同。转录因子ChIP-seq（TF ChIP-seq）专门研究被认为与特定DNA序列相关联以影响转录速率的蛋白质。
图4：具有生物学重复实验的转录因子ChIP-seq分析流程
图5：没有生物学重复实验的转录因子ChIP-seq分析流程
表3：转录因子ChIP-seq分析流程的inputs
表4：转录因子ChIP-seq分析流程的outputs
（3）流程指南
l 读长应至少为50个碱基对，鼓励更长的读长；分析流程可以处理低至25个碱基对的读长。可以配对或单端测序。
l 应注明使用的测序平台。不同的测序平台可能没有可比性。如HiSeq2000与HiSeq4000的重复不同，没有可比性。
l 重复应在读长和运行类型方面相匹配。
l Pipeline文件比对到人（GRCh38）和鼠（mm10）序列。
（4）现行标准
l 实验应该有两个或多个生物学重复。由于实验材料的可用性有限，使用EN-TEx样品进行分析可以例外。
l 抗体必须根据ENCODE Consortium制定的标准进行鉴定。
l 每个ChIP-seq实验应该有相应的input控制实验，具有匹配的运行类型，读长和重复结构。
l 使用非冗余分数（NRF）和PCR瓶颈系数1和2，PBC1和PBC2衡量文库复杂性。优选值如下：NRF>0.9，PBC1>0.9，PBC2>10。
特定目标标准
· 每个重复应该有不低于20M可用片段。
其他指标
在没有定义阈值的情况下计算额外的指标，例如FRiP（fraction of reads in peaks），在比较类似实验时很有用。
以上为ENCODE数据库中组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq数据标准及处理流程是简要说明，老师如果有染色质免疫共沉淀ChIP-seq测序需求，可与易基因联系。
参考来源：https://www.encodeproject.org/data-standards/
手把手教你做染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)分析实验
项目文章 | ChIP-seq揭示HIV-1感染细胞转录抑制因子Schlafen 5的表观遗传调控机制
项目文章｜ChIP-seq揭示H3K27me3去甲基化酶在体细胞重编程调控转录机制
