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此前,我们分享了DNA甲基化研究的测序数据挖掘思路(点击查看详情),进而鉴定出研究的目的基因或目标区域的DNA甲基化。
做完测序后,如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证,则需要进行下游实验设计。DNA甲基化研究的后期验证包括简单验证、全基因组甲基化干扰实验(非靶向)、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证等。
一、简单验证
二、全基因组甲基化干扰实验(非靶向)
l DNA甲基化干扰:
ü DNA甲基化酶的敲降/敲除/过表达
ü DNA甲基化抑制剂
阿扎胞苷(5-Aza)能够通过与DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共价键抑制其酶活性,使细胞的DNA甲基化水平降低。
l 检测整体DNA甲基化变化:
ü 5mC甲基化免疫荧光染色(定性)
ü DNA斑点杂交(定性)
ü 比色法(定量)
ü 质谱法(定量)
l 检测目标基因的DNA甲基化变化:Target-BS
l 检测目标基因的mRNA表达水平:RT-qPCR
l 检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot
三、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证
l 目的基因DNA甲基化的干扰:
ü 荧光素酶活性分析实验(Luciferase activity assay):使用CpG甲基转移酶在体外将质粒进行甲基化,构建含甲基化/未甲基化启动子的目标基因-荧光素酶表达质粒。
ü CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化实验:在细胞中人为表达目的基因,或通过CRISPR-Cas9系统靶向编辑DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修饰。
l 检测目标基因的DNA甲基化变化:Target-BS
l 检测目标基因的mRNA表达水平:RT-qPCR
l 检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot
l 检测细胞功能受到的影响:
ü 免疫荧光显微观察
ü 功能标志物测定
ü ... ...
CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化技术
目标区域DNA甲基化的验证手段——Target-BS(靶基因重亚硫酸盐测序)
关于易基因靶基因DNA甲基化测序(Target-BS)
对目标基因/CpG 位点甲基化检测,建立灵活的靶向甲基化测序技术。易基因建立的靶基因甲基化高通量测序(Target Bisulfite sequencing,Target-BS)是针对已有目标基因panel组合,运用易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件,对亚硫酸盐转化后的目标基因多重扩增,建库后进行超高深度(1000X以上)甲基化精准检测。
应用方向:
Target-BS广泛用于已知位点的甲基化Biomarker筛选、验证及临床转化应用
后续目标基因的甲基化验证
技术优势:
Ø 多基因多重扩增,检测通量高;
Ø 超高深度亚硫酸盐甲基化测序,相对于传统BSP克隆测序,检测灵敏度、准确性高,可准确检测到样本中低于1%的甲基化水平;
Ø 样本需求量低,20ng基因组DNA可实现多基因扩增;
Ø 适用范围广,对基因组DNA、FFPE样本、游离cfDNA等样本均适用;
Ø 检测费用显著低于现有技术、快周期、超高性价比。
典型案例:
Target-BS用于甲基化多位点甲状腺结节诊断
Target-BS发现食管鳞癌甲基化 biomarker
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