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此前,我们分享了m6A RNA甲基化研究的数据挖掘思路(点击查看详情),进而筛选出m6A修饰目标基因。
做完MeRIP-seq测序后,如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证,则需要进行下游实验设计。m6A RNA甲基化修饰目标基因的进一步验证或后期试验包括以下6个方面:
(1)简单验证
A. 目标基因m6A甲基化的验证:MeRIP-RT-PCR
B. 检测目标基因的mRNA表达水平:RT-qPCR
C. 检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot
(2)全局m6A甲基化干扰实验(非靶向),验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能
FB23-2给药后,大脑损伤组神经功能缺陷评分显著变差
(3)靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验,检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达
A. 目的基因m6A甲基化干扰细胞系的构建:荧光素酶活性分析实验(Luciferase activity assay)——构建含甲基化/未甲基化m6A位点的目标基因-荧光素酶表达质粒,转染细胞并表达。
B. 检测目标基因的m6A甲基化变化:MeRIP-qPCR
C. 检测荧光素酶报告基因的mRNA表达水平:RT-qPCR
D. 检测目标基因蛋白质表达水平:Western blot
E. 检测细胞功能受到的影响:免疫荧光显微观察、功能标志物测定... ...
用于验证目标基因上m6A甲基化功能的双荧光素酶报告系统
(4)研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达
A. 检测m6A是否通过影响目标基因翻译而影响蛋白质水平:
Polysome profiling
Ribo-seq
通过对结合核糖体上的mRNA进行定量,分析目标基因的蛋白翻译效率
通过对结合核糖体上的mRNA进行定量,分析目标基因的蛋白翻译效率
Polysome Profiling方法举例:
siMETTL3/14对目标基因与与核糖体的结合造成影响,对内参基因GAPDH无影响。
B. 研究m6A是否通过调节mRNA的稳定性和降解而影响目标基因蛋白水平
研究m6A对目标基因mRNA水平的影响
RT-qPCR
RNA-seq
METTL3/14干扰后,采用RT-PCR和RNA-seq检测目标基因的mRNA水平是否收到影响
C. 研究m6A是否通过调控RNA的出核(nuclear export)而影响目标基因蛋白水平
裂解细胞,超速离心分离细胞核与细胞质,然后分别进行RT-PCR实验检测细胞核与细胞质中的mRNA水平
METTL3/14干扰后,采用RT-PCR检测目标基因在细胞核与细胞质中的mRNA水平是否受到影响
(5)m6A修饰目标基因的表达回复实验
A. writers的突变/敲降/敲除实验:
RT-PCR检测目标基因的mRNA水平变化
Western blot检测目标基因的蛋白水平变化
检测目标基因的功能
B. writers的突变/敲降/敲除后,目标基因的过表达回复实验:
检测各项表型指数、细胞增殖、分化的回复情况