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被称为表观转录组（epitranscriptome）的RNA修饰正成为基因调控的广泛调控机制。由于绘制转录组范围RNA修饰测序策略的改进，以及分别对沉积、去除和识别RNA修饰的writers、erasers和readers密集表征，表观转录组学领域最近取得了较大进展。本文综述了近年来植物表观转录组及其在转录后基因调控和不同生理过程中调控机制的研究进展，主要重点介绍了N6-甲基腺苷（m6A）和5-甲基胞嘧啶（m5C）。
在植物表观转录组中，m6A是mRNA上最普遍和最经典的内部修饰，其他包括m5C、m1A和ψ图谱，也已经在一些植物的转录组范围内进行了分析，并鉴定出其writers。此外，植物mRNA在其5′端也被修饰，如经典的m7G或非经典的NAD caps（图1a）。
图1：植物表观转录组概述和表观转录组分析技术。
表观转录组分析技术的进展
（1）基于抗体、化学和酶的表观转录组分析
将下一代测序与修饰RNA的抗体免疫沉淀相结合，包括m6A-seq、m1A-seq、m5C-seq、hm5C-seq、Ac4C-seq和m7G-seq（图1b），是迄今为止最常用的绘制各种RNA修饰图谱的方法。m6A-seq揭示了真核生物中数千个具有独特且保守分布的转录本中m6A甲基化的普遍性，这些转录本优先分布在终止密码子周围和3′非翻译区（UTR）。然而，这些方法在表观转录组标记位点信息上的分辨率欠佳（100–200nt）。可以引入额外步骤来改进用于以单碱基分辨率检测RNA修饰的方法。首先，将UV交联步骤结合到RNA免疫沉淀中，如m6A单核苷酸分辨率交联和免疫沉淀（miCLIP）、m6A交联免疫沉淀（m6A-CLIP）和光交联辅助m6A测序（PA-m6A-seq），但如果不利用甲基化加标对照或input文库进行矫正或标准化，这些方法无法量化样品之间的差异修饰。其次，应用特异性逆转录酶来提高RNA修饰的检测分辨率，这些修饰在逆转录过程中会诱导错误掺入，这些方法包括使用逆转录酶TGIRT的m1A图谱，用于m1A甲基化的高分辨率分析。此外，已经开发出使用与不同样本的RNA连接的条形码适配器的m6A-seq2，用于同时检测不同样本的m6A动态，该方法可以扩展到使用其特异性抗体来检测其他RNA修饰。
尽管基于抗体的方法具有多功能性，但其应用必须依赖于高质量的抗体和大量的起始RNA。基于化学诱导标记的亚硫酸盐测序（BS-seq）以检测m5C RNA修饰（图1b）已被开发用于表观转录组标记检测。亚硫酸盐处理将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），从而产生一种可以以单核苷酸分辨率下绘制m5C的标记。在植物中，BS-seq已用于检测tRNA、rRNA和mRNA中的m5C。
酶技术的最新发展为以抗体非依赖性方式定量绘制m6A的精确位点提供了另一种有用的替代方案。这些技术要么利用m6A敏感的RNA限制性内切酶，如MAZTER-seq和m6A-REF-seq，要么利用m6A-erasers/readers，如m6A-SEAL和DART-seq，或利用二甲基转移酶如MjDim1将m6A转化为m62A的m6A选择性烯丙基化学标记和测序（m6A-SAC-seq）。
（2）Nanopore直接RNA测序检测表观转录组标记位点
尽管上述基于下一代测序方法的表观转录组分析方法为RNA修饰分布和调控提供了前所未有的见解，但在多个样品中定量绘制RNA修饰图谱仍然存在挑战。此外这些方法在很大程度上依赖于基于短读长cDNA的测序，其需要将RNA转化为cDNA。相比之下，Nanopore（纳米孔）长读长直接RNA测序（DRS）平台正在成为一种有前途的方法，用于定量绘制和比较不同条件下单核苷酸分辨率的RNA修饰（图1b）。在植物中，通过nanopore DRS为两个m6A-writers缺失的拟南芥突变体生成了高分辨率的差异和比较m6A甲基化组。此外，nanopore DRS和Tombo已被用于鉴定拟南芥中的m5C peaks，其总体模式与m5C-seq鉴定相似。
此外还开发了RAM-NPPS、BERMP和PEA等方法来检测植物中的m6A水平。其中PEA检测拟南芥中m6A的敏感性和特异性超过70%。所有检测方法都有其优点和缺点，如不同的m6A分析技术需要从100 ng到20μg的不同RNA起始量，具有不同的检测分辨率和推断化学计量信息的能力（图1c）。在设计表观转录组分析研究时，应将这些特征与要解决的生物学问题结合起来考虑。
表征植物表观转录组参与者的研究进展