2021年03月02日，杜克大学医学中心的分子遗传学和微生物学系Stacy M. Horner教授团队在《Cell Reports》（IF: 9.995）杂志发表了题为“Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine”的研究论文，研究通过MeRIP-seq（m6A-seq）等实验揭示了m6A在抗病毒限制的I型干扰素（interferon，IFN）响应期间对IFN刺激基因（IFN-stimulated genes ，ISG）翻译的转录调控机制。
标题：Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine
时间：2021.03.02
期刊：Cell Reports
影响因子：IF 9.995
技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq、Ribo-seq、MeRIP-qRT-PCR、荧光素酶活性分析实验等
研究摘要
I型干扰素（interferon，IFN）通过诱导数百种IFN刺激基因（ISG）来响应病毒感染，必须调节这些ISG的诱导以实现有效和可调控的抗病毒感染响应，但这些基因的转录调控机制尚不明确。本研究首先鉴定了RNA碱基修饰N6-甲基腺苷（m6A）在ISG调控中的作用，通过Ribo-seq和定量质谱法结合m6A免疫沉淀测序（MeRIP-seq）分析，鉴定出包含IFITM1的ISG亚群，其翻译通过m6A和m6A甲基转移酶蛋白METTL3和METTL14增强。研究进一步表明m6A识别蛋白（readers）YTHDF1以m6A结合依赖性方式上调IFITM1表达，且m6A甲基转移酶复合体可以促进I型IFN的抗病毒活性。总之，本研究表明m6A在抗病毒限制的I型IFN响应期间对ISG翻译的转录调控中发挥作用。
实验结果
（1）METTL3/14调节某些ISG的翻译
IFN-β通过诱导ISG转录形成对病毒感染的响应。为研究m6A是否调节I型IFN响应，本研究对Huh7细胞中m6A甲基转移酶复合体METTL3/14缺失后，IFN-β诱导的几种具有抗病毒功能的ISG表达进行检测。在METTL3/14敲除后，IFN-β诱导的ISG IFITM1和MX1蛋白表达降低（图1A），同时在A549细胞、原代新生儿人真皮成纤维细胞（NHDF）和Huh7细胞中IFN-β处理后的多个时间点（8h、16h和24h）观察到相似结果；但MX1蛋白水平在A549和NHDF细胞中的影响不如在Huh7细胞中强烈。而为响应IFN-β，METTL3/14过表达增加了Huh7细胞中的IFITM1和MX1丰度，但没有增加ISG15和EIF2AK2的丰度（图1B）。METTL3/14调节的ISG IFITM1和MX1在没有IFN-β的情况下不表达，表明METTL3/14动态变化对内源性IFN-β的任何混杂效应可以忽略不计（图1A和1B）。
图1：METTL3/14调节某些ISG的翻译
（A-B）在模拟或IFN-β（24h）处理之前，用siRNA转染METTL3/14（M3/14）或对照（CTRL）（A）或稳定过表达FLAG-METTL14（M3/14OE；上箭头表示FLAG-METTL14；下箭头表示内源性METTL14）（B）的Huh7细胞提取物的免疫印迹分析。相对于非靶向对照（siCTRL）+IFN-β（A）或WT+IFN-（B），对A和B中4个重复的相对ISG表达进行定量。
（C-E）用CTRL或METTL3/14 siRNA转染后经IFN-β处理的Huh7细胞提取物中分离24个蔗糖梯度级分中的IFITM1（C）、MX1（D）和GAPDH（E）mRNA相对百分比qRT-PCR分析。未初始化（游离、40S和60S亚基）、初始化（80S）、低分子量或高分子量多核糖体。右边的图表显示了IFITM1、MX1或GAPDH组合级分中的mRNA百分比。将各部分的百分比相加得出各类别的总百分比。
数值为4个生物学重复（A和B）的平均值±SEM，3个技术重复平均值±SD，表示3个实验（C–E，左图）和3个生物学重复的平均值±SEM（C–E，右图）。*非配对Student's t检验（A和B）和Sidak多重比较检验的双向方差分析（C–E），*p<0.05，***p<0.01，***p<0.005，ns，不显著。
为研究METTL3/14如何调节某些ISG的蛋白水平，研究首先分析METTL3/14缺失是否导致ISG mRNA对IFN-β响应减少。同时，在IFN-β处理后使用RNA测序（RNA-seq），结果显示METTL3/14缺失对核心ISG的mRNA表达丰度影响很小，表明ISG RNA稳定性不受METTL3缺失的影响。
由于METTL3/14缺失导致IFITM1和MX1蛋白减少而不影响其转录水平，本研究分析METTL3/14是否调节其蛋白稳定性。研究结果表明METTL3/14不能检测到Huh7细胞中这些ISG的出核或蛋白质稳定性。
为了检测METTL3/14是否调节IFITM1翻译，作者检测了其在对照细胞或IFN-β处理后METTL3/14缺失的细胞中的多核糖体（polysome）百分比。结果显示METTL3/14缺失不改变总多核糖体水平，但METTL3/14缺失会导致80S级分中IFITM1 mRNA水平较低，且从重多核糖体级分转换为轻多核糖体级分（图1C），表明METTL3/14缺失后IFITM1翻译受损。另外，在MX1（图1D）中也观察到类似但不太明显的变化，但在GAPDH（图1E）中没有观察到。总之结果表明，METTL3/14调节某些ISG的翻译，如IFITM1和MX1。
（2）METTL3/14调节的ISG被m6A修饰
为确定METTL3/14调节的ISG IFITM1和MX1以及其他ISG是否被m6A修饰，研究通过使用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）在Huh7细胞中绘制了IFN诱导的转录组m6A图谱，在鉴定出ISG后，将m6A免疫沉淀后reads覆盖率的peaks，与使用MeTDiff m6A peaks calling的input进行比较。结果显示mRNA peaks在编码序列末端和3′UTR起始位点富集（图2A）。peaks内最富集的RNA序列motif为[U/A]GGAC，这与DRAmC已知m6A motif匹配（图2A）。约85%的ISG（分类为IFN后上调超过4倍的ISG）被m6A修饰，而Huh7细胞表达转录组中比例为74%（平均覆盖率≥10）（图2B）。该结果与先前的研究一致，该研究发现ISG以与转录组相似的百分比进行m6A修饰。m6A修饰的ISG百分比在其他类别的ISG中相似，包括脊椎动物中进化保守的“核心”ISG和具有已知抗病毒功能的核心ISG的14个亚群（图2B）。接下来，利用MeRIP-seq数据生成了IFITM1、MX1、ISG15和EIF2AK2图，并使用m6A peaks calling 方法MeTDiff和meRIPPer揭示METTL3/14调节基因IFITM1和MX1具有m6A peaks（图2C和2D），而ISG15和EIF2AK2没有m6A peaks（图2E和2F），这些图表明ISG15的3'UTR也可能包含m6A位点（图2E）。将MeRIP-seq实验中ISG的m6A状态与已发表的研究数据进行比较，比较结果显示在所有研究中核心抗病毒ISG的m6A状态预测一致。dsDNA处理有效地激活IFN产生并诱导本实验中发现的相同核心抗病毒ISG的m6A修饰。HCMV感染也导致某些ISG的m6A修饰，这种病毒编码抑制IFN信号因子；因此ISG可能不像dsDNA或IFN-β处理那样强烈诱导。m6A在许多ISG上的存在表明m6A可以调节抗病毒I型IFN响应。
图2：METTL3/14调节的ISG由m6A修饰
（A） 在IFN-β处理（8h）后，转录组范围内的m6A分布Metagene图，绘制了具有统计学意义的peaks 中DRACH motif位点相对位置，以及peaks中最富集的motif。
（B） 在表达的转录组中由m6A修饰的基因百分比，响应于IFN-β处理（ISG）的mRNA诱导≥4倍的基因，脊椎动物中保守的核心ISG，或具有抗病毒功能的核心ISG亚群。
（C-F）在IFITM1（C）、MX1（D）、ISG15（E）和EIF2AK2（F）转录本中MeRIP（红色）和input（黑色）reads覆盖图。生物学重复的差异由reads覆盖范围周围的红色和黑色阴影表示，灰色阴影表示编码序列，黄色阴影表示由MeTDiff和meRIPPer的m6A peaks calling软件。所有分析均在3个生物学重复上进行。
（3）IFITM1在3′UTR中的m6A修饰增强了其翻译
m6A增强了某些mRNA的翻译。具体而言，m6A识别蛋白（readers）YTHDF1在3′UTR内识别m6A，并与真核翻译起始因子（如eIF3）结合，以增强m6A修饰转录本的翻译。为METTL3/14对ISG的翻译调节是否是通过m6A诱导，研究使用IFITM1作为METTL3/14调节的ISG模型。首先确定METTL3/14缺失对IFITM1 m6A修饰的影响。MeRIP-qRT-PCR结果表明IFITM1 mRNA在m6A阴性ISG EIF2AK2和m6A阴性合成RNA中富集，证实其含有m6A。METTL3/14缺失降低了IFITM1 mRNA的m6A富集，但没有降低m6A阴性EIF2AK2转录本或m6A阴性合成RNA的富集（图3A和3B），数据表明IFITM1是由METTL3/14修饰的m6A。
图3：IFITM1在 3'UTR中的m6A修饰增强了翻译
（A） 在用siCTRL或METTL3/14 siRNA处理并掺入m6A阴性（NEG）寡核苷酸的Huh7细胞中，由IFN-β（8h）诱导的ISG的相对m6A水平的代表性MeRIP qRT-PCR分析。
（B） A中5个生物学重复每个基因的相对富集百分比，归一化为siCTRL。
（C） 野生型（WT）和突变型ISRE-m6A缺失的Renilla荧光素酶（R-Luc）IFITM1 3'UTR报告基因示意图，该报告基因也从单独的启动子表达m6A缺失的萤火虫荧光素酶（F-Luc）。
（D）经IFN-β（8h）处理的转染Huh7细胞的WT和m6A-mut IFITM1 3'UTR报告RNA的相对m6A水平的MeRIP-qRT-PCR分析。
（E）用siRNA转染的Huh7（24h）、然后进行报告基因转染（24h）和用IFN-β处理（8h）的WT和m6A-mut IFITM1 3'UTR报告基因RNA的相对m6A水平的MeRIP-qRT-PCR分析，。
（F） 报告基因转染（24h）和IFN-β处理（8h）后，在Huh7细胞中归一化为HPRT1的WT和m6A-mut IFITM1 3'UTR报告基因mRNA表达的qRT-PCR分析。
（G） IFN-β诱导的WT和m6A-mut IFITM1 3′UTR报告基因中的相对萤光素酶活性（R-Luc/F-Luc）（相对于模拟8h）。
在鉴定出IFITM1是m6A修饰之后，接下来生成了一个荧光素酶报告基因，其中包含IFN刺激的响应元件（ISRE）-启动子驱动的Renilla萤光素酶，所有DRAC motif被敲除（m6A-null R-Luc），然后与野生型（WT）IFITM1 3′UTR或类似的3′UTR序列结合，IFITM1中3′UTR m6A peaks中的四个推定m6A motif从A→G转换（m6A-mut）（图3C）。分析数据结果表明， METTL3/14通过向3'UTR添加m6A修饰来调节IFITM1翻译，并且IFITM1 3'UTR内的m6A修饰足以增强其翻译。
（4）YTHDF1以m6A依赖性方式增强IFITM1蛋白表达
为检测YTHDF1是否诱导m6A对ISG的翻译促进作用，研究人员在Huh7细胞中稳定过表达YTHDF1（H7Y1）或m6A结合缺陷型YTHDF1蛋白（H7Y1mut）并分析其相对于亲本Huh7细胞（H7）在24h后IFN诱导的ISG表达。YTHDF1过表达增加响应IFN-β的IFITM1蛋白表达，而m6A结合缺陷型YTHDF1蛋白（H7Y1mut）的过表达不增加IFITM1丰度（图4A和4B）。且野生型（WT）和突变型YTHDF1过表达不会显著影响IFN-β处理后的IFITM1 mRNA水平，表明YTHDF1不直接调控IFN信号或IFITM1 mRNA稳定性（图4C）。YTHDF1过表达显著改变IFN诱导的含m6A的ISG MX1表达，或不含m6A的ISG ISG15和EIF2AK2表达（图4A和4B）。而在IFN-β处理后，YTHDF1缺失会导致IFITM1蛋白表达降低，但MX1、ISG15和EIF2AK2未受影响（图4D）。另外，WT YTHDF1与IFITM1、MX1、ISG15和m6A阳性对照SON的转录本结合，而m6A结合缺陷型YTHDF1突变蛋白则没有结合。含有非m6A的mRNA EIF2AK2和RPL30不与任一蛋白结合（图4E和4F）。总之，这些结果表明YTHDF1与IFITM1 mRNA上的m6A结合，且通过其m6A结合活性增强其翻译是必要和充分的。YTHDF1与ISG15 mRNA明显的m6A依赖性结合表明ISG15 mRNA实际上是m6A修饰。在ISG15 mRNA的input reads与MeRIP-seq reads的关联图揭示了其3'UTR中m6A富集的潜在区域（图2E）。因此，YTHDF1在促进翻译中具有转录本特异性作用，因为它结合了IFITM1、MX1和ISG15的转录本，但其过表达仅足以显著增加IFITM1的蛋白生成。
图4：YTHDF1以m6A依赖性方式增强IFITM1蛋白表达
（A） 在模拟或IFN-β（24h）处理后稳定过表达FLAG-YTHDF1 WT（Huh7Y1）或FLAG-YTHDF1 W465A（Huh7Y1mut）的Huh7细胞提取物的免疫印迹分析。
（B） A的3个独立实验中IFN-β处理后ISG表达定量，归一化为总蛋白并相对于siCTRL绘图。
（C） 在IFN-β（24h）处理后稳定过表达FLAG-YTHDF1 WT（Huh7Y1）或W465A（Huh7Y1mut）的Huh7细胞中归一化为HPRT1的ISG mRNA表达的qRT-PCR分析。
（D） 在模拟或IFN-β（24h）处理之前，用siRNA转染YTHDF1（siY1）或siCTRL的Huh7细胞提取物的免疫印迹分析。数据代表3个独立的生物学实验。
（E） 与IFN-β（8h）处理后Huh7细胞的FLAG-GFP相比，FLAG-YTHDF1 WT（Y1）或W465A（Y1mut）的免疫沉淀（IP）后mRNA富集的qRT-PCR分析。将IP值归一化为input值并绘制为GFP的倍数富集。
（F） E中使用的FLAG免疫沉淀和input级分的免疫印迹分析。
（5）METTL3/14和m6A促进ISG亚群的翻译
为鉴定蛋白表达受METTL3/14调节的其他ISG，使用基于定量质谱的蛋白质组学和氨基酸稳定同位素标记（SILAC）来比较IFN-β处理后siCTRL和siMETTL3/14细胞的蛋白质组。与siCTRL相比，siMETTL3/14对蛋白丰度的影响集中在大多蛋白质的对数比为0，表明METTL3/14缺失对IFN-β处理后的蛋白质水平没有整体影响。在先前的RNA-seq实验中，将ISG定义为通过IFN-β处理上调>2倍的基因来确定哪些蛋白是ISG。尽管质谱法检测ISG有限（n=18），但鉴定出一些METTL3/14调节的ISG（图5A；MS）。METTL3/14缺失后，大多数这些ISG的蛋白表达降低，且这些ISG包括先前鉴定的m6A修饰的IFITM1（对应于IFITM1/2/3的肽）和MX1，以及其他抗病毒ISG如OAS2和不同的HLA-C链（图5A），均由m6A修饰。通过将这些数据与之前的RNA-seq实验数据进行比较，结果表明METTL3/14对这些ISG蛋白水平的影响不由其mRNA表达调节来确定，因为METTL3/14缺失后，本实验中在蛋白水平上降低的ISG的mRNA丰度没有降低，表明翻译调控如先前对IFITM1和MX1的多核糖体分析所表明结果一致（图1C和1D；图5A，RNA）。并非所有通过质谱法鉴定的m6A修饰的ISG都受METTL3/14缺失调节（图5A；m6A），表明METTL3/14和m6A调节ISG的亚群并支持其蛋白表达。
图5：METTL3/14调节ISG亚群的翻译
（A） 3列热图显示了IFN-β处理后METTL3/14缺失对Huh7细胞中ISG表达的影响。第一列显示定量质谱法检测蛋白质估计值的log2倍变化（siMETTL3/14与siCTRL + IFN-β 24 h；n=2个生物学重复）。第二列显示独立RNA-seq实验（siMETTL3/14与siCTRL + IFN-β 8 h；n=3个生物学重复）的mRNA reads的log2倍变化。第三列显示MeRIP-seq数据的m6A状态（+表示m6A阳性；-表示m6A阴性）（+IFN-β 8h；n=3个生物学重复）。基因包括RNA-seq的IFN诱导超过2倍的任何ISG，这些ISG也可以通过质谱法检测到，其他图中的ISG以粗体显示。由于IFITM1/2/3相似，因此使用此表示法表示从该蛋白质家族中检测到的肽；RNA-seq倍数变化和m6A状态对应于带下划线的数字，调整后*p<0.05。
（B） METTL3/14缺失对ISG表达影响的四象限散点图。y轴是Ribo-seq的核糖体保护片段的log2倍变化（siMETTL3/14超过siCTRL），x轴是来自独立RNA-seq实验的mRNA读数的log2倍变化（siMETTL3/14与siCTRL）。m6A修饰（蓝色）或m6A阴性（灰色）基因。对其他图中的ISG进行了标记。
（6）METTL3/14增强了IFN响应的抗病毒作用
METTL3/14在I型IFN响应期间增强ISG亚群表达，表明它可能是最佳抗病毒所必需。研究人员检测了METTL3/14动态变化后I型IFN限制负义链RNA病毒水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）感染的能力。VSV基因组包含了m6Am帽修饰，但由于这种修饰沉积不受METTL3/14调控，因此VSV复制可能不会受到METTL3/14动态变化的直接影响，而对VSV复制的任何影响可能由宿主转录本的甲基化介导。通过使用小干扰RNA（siRNA）或过表达来干扰METTL3/14的表达，然后使用显微镜在存在和不存在低剂量IFN-β预处理（6h；40U/mL）的情况下，检测感染后6小时被VSV感染的细胞百分比。在感染后早期时间点检测VSV感染，可以在感染直接诱导的ISG细胞上调之前检测到病毒复制。结果显示，在没有IFN-β预处理的情况下，任何条件下都没有看到VSV诱导ISG（图6A和6B）。通过免疫印迹或定量感染细胞百分比分析来检测VSV复制，在没有IFN-β处理情况下，METTL3/14缺失或过表达没有变化（图6）。在IFN-β预处理后，METTL3/14缺失导致METTL3/14调节的ISG表达降低（图6A），而METTL3/14过表达则上调其表达（图6B）。尽管IFN-β预处理减少了VSV病毒复制，但METTL3/14缺失降低了IFN-β限制VSV的能力，而METTL3/14过表达则会增强IFN介导的VSV限制（图6）。总之这些数据表明METTL3/14增强了I型IFN的抗病毒特性，是有效IFN介导的抗病毒响应所必需的。
图6：METTL3/14增强了I型IFN响应的抗病毒作用
（A-B） 用siRNA（A）转染或稳定过表达FLAG-METTL14的Huh7细胞提取物的代表性免疫印迹分析（n=3），其也增强METTL3表达（M3/14OE）；用IFN-β（6h）或模拟物处理，然后进行VSV感染（MOI=2；6h）（B）。箭头表示FLAG-METTL14（上）和内源性METLL14（下）。
（C-D） 用siCTRL或METTL3/14 siRNA（C）或稳定过表达FLAG-METTL14（METTL3/14OE；D）处理的Huh7细胞的代表性显微图，这些细胞用IFN-β预处理（6h），然后进行VSV感染（MOI=2；6h），对3个独立实验感染的细胞百分比进行定量，每个条件5个视野，每个视野>150个细胞，归一化为未经IFN处理的siCTRL或WT，如右图所示。比例尺：100μm。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤响应、癌症发生与发展、药物响应等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
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参考文献：
McFadden MJ, McIntyre ABR, Mourelatos H, Abell NS, Gokhale NS, Ipas H, Xhemalçe B, Mason CE, Horner SM. Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine. Cell Rep. 2021 Mar 2;34(9):108798.
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