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中药小檗碱（Berberine，BBR，化学式C20H18NO4）是从几种药用植物中分离出的一种异喹啉季生物碱，包括小檗（Berberis aristata）和黄连（Coptis chinensis）。小檗碱可改善脂质代谢紊乱诱导的细胞氧化应激、凋亡和自噬，但其分子机制尚不清楚。
斑马鱼（Danio rerio，Cyprinidae）是发育、遗传和繁殖的重要脊椎动物模式生物。肝脏是脂肪合成的主要器官，鱼类体内约90%的脂肪在肝脏中合成，肝脏在维持碳水化合物、氨基酸和脂肪酸的代谢平衡中发挥着重要作用。有许多研究使用斑马鱼肝细胞（Zebrafish hepatocyte，ZFL）来研究体外脂肪沉积。
2022年11月30日，上海交通大学徐维娜团队在《Antioxidants》杂志发表题为“Berberine Regulation of Cellular Oxidative Stress, Apoptosis and Autophagy by Modulation of m6A mRNA Methylation through Targeting the Camk1db/ERK Pathway in Zebrafish-Hepatocytes”的研究论文，该研究以斑马鱼肝细胞（ZFL）作为代谢综合征合并氧化应激研究的模型系统，通过MeRIP-seq等实验揭示了m6A RNA甲基化修饰在体外用小檗碱处理的ZFL脂质沉积中的作用。
标题：Berberine Regulation of Cellular Oxidative Stress, Apoptosis and Autophagy by Modulation of m6A mRNA Methylation through Targeting the Camk1db/ERK Pathway in Zebrafish-Hepatocytes（小檗碱通过靶向斑马鱼肝细胞中的Camk1db/ERK通路介导m6A mRNA甲基化以调控细胞氧化应激、凋亡和自噬）
时间：2022.11.30
期刊：Antioxidants
影响因子：IF 7.675
技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP -PCR、Western Blot等
研究摘要
为理解BBR改善脂质代谢紊乱诱导的细胞氧化应激、凋亡和自噬相关分子机制，本研究分析了m6A甲基化修饰在脂质沉积斑马鱼肝细胞（ZFL）中的作用。结果表明，BBR促进肝细胞m6A RNA甲基化水平发生变化，增加Camk1db基因转录本的m6A水平并改变Camk1db基因的mRNA表达。通过敲除Camk1db基因，Camk1db可促进细胞ERK磷酸化水平。小檗碱通过改变Camk1db基因的m6A RNA甲基化来调控Camk1db mRNA表达水平，进而影响钙调蛋白依赖性蛋白激酶合成和ERK信号通路激活，从而导致下游ROS产生、细胞增殖、凋亡和自噬等生理指标发生变化。本研究结果表明小檗碱可以通过靶向斑马鱼肝细胞中的Camk1db/ERK通路介导Camk1db m6A甲基化，从而调控细胞氧化应激、凋亡和自噬。
示意图：小檗碱介导Camk1db/ERK1/2信号通路机制
研究结果
1、小檗碱对棕榈酸钠诱导的脂肪沉积斑马鱼肝细胞氧化应激、凋亡和自噬的调控
图1：ZFL内不同处理组氧化应激指标及ZFL透射电镜图。
（A） MDA（丙二醛）。（B） T-AOC（总抗氧化能力）。（C） ROS相对表达。（D） ROS荧光显微镜图片。
图2：小檗碱对棕榈酸钠诱导的肝细胞凋亡和自噬的影响。
（A） 流式细胞术检测ZFL细胞凋亡，每组细胞计数为10000。（B） ZFL的凋亡和凋亡率。（C） P62蛋白和LC3-B蛋白的WB图。（D） P62蛋白相对表达水平。（E） LC3-B蛋白相对表达水平。
2、小檗碱在棕榈酸钠诱导斑马鱼肝细胞m6A甲基化及转录水平中的作用
（1）m6A甲基化分析
从四个实验组收集细胞：对照组（control）、脂质沉积组（SP）、小檗碱组（BBR）和脂质沉积+小檗碱组（SP+BBR），采用MeRIP-seq高通量测序进行甲基化分析，以研究小檗碱对脂质沉积诱导斑马鱼细胞m6A甲基化的影响。如下表所示，在甲基化位点数上，小檗碱组检测到的甲基化位点最多，其次是脂质沉积+小檗碱组和对照组，脂质沉积组检测到的甲基化位点最少。结果表明，脂质沉积和小檗碱的添加会影响斑马鱼肝细胞m6A甲基化位点数量。
表1：4个实验组的甲基化位点数量比较
为研究m6A位点在mRNA上的分布，根据m6A peaks在转录本上的分布将其分为四个区域：5'非翻译区（5'UTR）、3'非翻译区（3'UTR）、第一外显子（1st Exon）和其他外显子（Other Exon）。结果表明，大多数m6A peaks位于3'UTR区，其次是5'UTR区和Other Exon区。与对照组相比，脂质沉积组3''UTR和5''UTR区m6A peaks显著增加，而添加小檗碱后3'UTR区m6A peaks显著降低，5'UTR区的m6A peaks进一步增加。m6A peaks具有较高的富集倍性，表明脂质沉积诱导的斑马鱼肝细胞具有不同的m6A甲基化模式，且添加适量的小檗碱改变了这些m6A甲基化模式。
图3：ZFL中各组m6A peaks分布
RNA的甲基化和去甲基化过程需要蛋白与甲基化位点motif的结合。对于四组样品的motif预测，使用分析软件HOMER用于在peaks区域中寻找高度可行性的motif。分析结果在四组中多次出现和高度相似的motif，揭示了斑马鱼甲基化位点的潜在motif。结果表明，4个不同处理组均含有“RRACH”motif，表明斑马鱼也符合其他物种的一般模式，证实了本实验结果的可靠性，可用于后续分析。
图4：m6A甲基化分析。
（A） ZFL中不同处理组的前十个motif分析。（B） 每组前六位motif分析*-可能为假阳性。
（2）转录组分析
从四个实验装置组收集细胞用于转录组分析：对照（control），脂质积累组（SP），小檗碱组（BBR）和脂质积累+小檗碱组（SP+BBR）。
图5：各组转录差异基因的KEGG富集分析。
（A） SP组与对照组比较。（B） BBR组与对照组比较。（C）SP+BBR组与对照组比较。（D） SP+BBR组与SP组比较。（E）BBR组与SP组比较。（F）SP+BBR组与BBR组比较。
（3）m6A甲基化组和转录组关联分析
对于转录水平和甲基化水平的相关性分析，分别分析了各组的甲基化水平和转录水平变化基因数量，以及各组同时在甲基化水平和转录水平存在显著差异的基因数量，还对甲基化水平和转录水平的显著差异基因进行KEGG通路富集分析（图6）。
图6：各组甲基化和转录水平差异显著基因的KEGG富集分析。
（A） SP组与对照组比较。（B） BBR组与对照组比较。（C） SP+BBR组与对照组比较。（D） SP+BBR组与SP组比较。（E）BBR组与SP组比较。（F）SP+BBR组与BBR组比较。
（4）靶基因筛选
甲基化-转录水平关联分析的筛选过程主要靶向甲基化水平显著变化和转录水平显著差异的基因（p<0.05）（Fc≥2）。从中筛选出斑马鱼的Camk1db基因作为下一步研究的候选基因。与对照组相比，脂质沉积组Camk1db基因的m6A RNA甲基化水平显著降低，转录水平降低但无显著差异。小檗碱组的甲基化水平和转录水平显著高于脂质沉积组。与脂质沉积组相比，脂质沉积+小檗碱组的甲基化水平和转录水平也显著增加。
3、Camk1db基因甲基化及其对ZFL细胞稳态调控的验证
图7：验证Camk1db基因甲基化及其对ZFL细胞内稳态的调控作用。
（A）ZFL中Camk1db基因的m6A甲基化水平。（B）Camk1db基因在ZFL中的相对mRNA表达。（C）肝细胞活性。（D）细胞内ROS相对表达。（E）细胞凋亡率。（F）LC3-B和P62蛋白的WB图。（G）P62蛋白的相对含量。（H）LC3-B蛋白的相对含量。（I，J）P-ERK/ERK蛋白转染前后的WB图和相对水平。（K，L）不同处理组（对照组、SP组、BBR组、SP+BBR组）P-ERK/ERK蛋白的WB 图和相关蛋白表达。
结论：
本研究探讨了小檗碱对棕榈酸钠诱导的ZFL细胞氧化应激、凋亡和自噬等生物学功能的影响，同时确定了细胞RNA m6A甲基化的新方向，筛选出关键差异基因Camk1db。研究结果为鱼类养殖业中保肝中草药的研究与开发提供分子理论基础。然而，仍然存在一些尚未解决的问题。有必要阐明m6A甲基化在体内氧化应激过程调控中的作用。
参考文献：
Zhang M, Liu J, Yu C, Tang S, Jiang G, Zhang J, Zhang H, Xu J, Xu W. Berberine Regulation of Cellular Oxidative Stress, Apoptosis and Autophagy by Modulation of m6A mRNA Methylation through Targeting the Camk1db/ERK Pathway in Zebrafish-Hepatocytes. Antioxidants (Basel). 2022 Nov 30;11(12) pii: antiox11122370.
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