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滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）是一种著名的中药材，其花药在花粉成熟后表现出独特的周期性开裂和闭合的生理特性。其种子具有“次生休眠”特性，导致发芽率低、繁殖效率差。种子休眠受植物激素（如赤霉素和脱落酸）含量及比例影响，而这些激素的合成基因表达又受温度、光照和种子含水量等因素调控。此外，滇重楼的花药在花粉成熟后会出现独特的周期性开裂和闭合现象，但这种现象对种子休眠的调控机制尚不清楚。

近日，昆明学院农学与生命科学学院王斌教授团队通过RNA测序和DNA甲基化测序，比较了花粉和种子在花药开裂与闭合过程中的基因表达和甲基化变化，并结合不同花粉授粉模型，分析了这些变化对种子休眠的调控机制。相关研究成果以“Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy”为题发表在《Frontiers in Plant Science》期刊。深圳市易基因科技为本研究提供DNA甲基化测序（RRBS）技术服务。

研究人员结合RNA测序（RNA-seq）和简化基因组DNA甲基化测序（RRBS）技术，分析了花药开裂和闭合过程中花粉和种子的基因表达谱以及甲基化变化，并研究了低温处理后的影响。通过KEGG通路富集分析，鉴定出温度相关甲基化变化敏感的基因簇（clusters）。

研究设置四种花粉处理模型：正常对照组、“低温保护花粉”组、“刚开裂花药的花粉”组和“闭合阻断花药的花粉”组，通过人工授粉产生相应的种子。随后利用qRT-PCR技术验证在不同处理条件下，授粉种子中标记基因表达模式变化。

通过转录组分析，研究者鉴定出花药与正常组织之间的差异显著表达基因，以及与低温处理花粉和种子相关的甲基化变化基因区域。氧化磷酸化（ko00190）、植物激素信号转导（ko04075）和玉米素生物合成（ko00908）三条信号通路表现出显著的基因表达和甲基化变化富集。尤其是NADH-泛醌氧化还原酶链5、质膜ATP酶4、细胞色素c氧化酶亚基2、玉米素-O-葡萄糖基转移酶、ABA不敏感蛋白5类似蛋白4和吲哚-3-乙酸酰胺合成酶（IAAS）等被鉴定为易受温度诱导的甲基化变化影响的基因簇。

不同花粉授粉模型的评估结果显示，IAAS、蔗糖合成酶（SUS）、赤霉素2-氧化酶（GA2ox）、ABA不敏感蛋白2（ABI2）和生长素抑制蛋白（ARP）这五个与休眠调控相关的标记基因在闭合阻断花药的花粉、低温保护的花粉以及刚开裂花药的花粉三种情况均表现出差异表达模式。闭合阻断花药处理导致IAAS、SUS、GA2ox和ABI2的表达显著上调，而ARP表达则显著下调，这表明闭合阻断花药处理倾向于延长种子休眠期。而在低温保护的花药模型中，SUS、ARP、GA2ox和IAAS的表达水平降低，ABI2表达上调，总体上促进种子萌发。