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近日，复旦大学附属中山医院liang bugang、郑懿民等为并列第一作者，沈英皓、柯爱武为共同通讯作者，在《Hepatology》杂志发表了题为“The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in HCC”的科研论文。该研究聚焦肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）中仑伐替尼（Lenvatinib）耐药这一临床难题，通过一系列实验探究了其耐药机制。研究利用转录组和蛋白质组测序分析，揭示了微管相关丝氨酸/苏氨酸激酶样蛋白（Microtubule-associated serine/threonine kinase-like, MASTL）在仑伐替尼耐药的 HCC 细胞和组织中高表达，并通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）等研究进一步揭示应激激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 24（Serine/threonine protein kinase 24, STK24）调控的 MASTL/YBX1/PAK4 轴在 HCC 中介导仑伐替尼耐药和肿瘤进展的关键作用，为突破HCC 仑伐替尼耐药提供了潜在的治疗靶点。易基因为本研究提供了ChIP-seq技术服务，助力揭示MASTL信号轴在耐药中的关键作用。
论文标题：The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in HCC（应激激活的STK24调控MASTL/YBX1/PAK4轴介导肝细胞癌仑伐替尼耐药和肿瘤进展）
发表时间：2025年6月2日
发表期刊：Hepatology
影响因子：IF15.8/Q1
技术平台：转录组、蛋白质组、表观基因组（ChIP-seq）等（易基因金牌技术）
作者单位：复旦大学附属中山医院
DOI：10.1097/HEP.0000000000001392
许多肝细胞癌（HCC）患者对仑伐替尼治疗反应不佳。因此，阐明耐药的潜在机制并制定有效的逆转策略至关重要。本研究首先对仑伐替尼耐药的细胞系和患者来源样本进行转录组和蛋白质组测序分析，确定MASTL是与HCC中仑伐替尼耐药密切相关的关键因子。随后，研究人员利用皮下注射小鼠模型、半数抑制浓度（IC50）实验和集落形成实验，揭示了MASTL在促进肿瘤生长和介导仑伐替尼耐药的生物学功能。为进一步阐明潜在机制，免疫共沉淀和质谱分析揭示了MASTL促进YBX1蛋白磷酸化。通过染色质免疫沉淀实验（ChIP-seq），研究进一步验证磷酸化的YBX1在转录水平上介导PAK4激活，确定PAK4是MASTL通路的下游效应分子。此外，质谱分析和磷酸化分析表明，STK24可以在仑伐替尼作用下激活HCC中的MASTL。而阻断MASTL/YBX1/PAK4信号轴可恢复HCC对仑伐替尼的敏感性。
本研究结果表明，由应激诱导的STK24激活MASTL/YBX1/PAK4轴在仑伐替尼耐药中发挥关键作用。通过靶向MASTL抑制该轴可有效克服HCC中的仑伐替尼耐药。
研究方法
l 细胞系构建：建立仑伐替尼耐药的 PLC/PRF/5-R（PLC-R）和 MHCC97H-R（97H-R）细胞系，为后续研究耐药机制提供模型。
l 临床样本收集：从接受仑伐替尼治疗的 HCC 患者中获取穿刺活检样本，根据影像学评估的肿瘤反应情况，将患者分为部分缓解（Partial response, PR）和耐药（Progressive disease, PD）两组，同时收集手术样本及组织微阵列（Tissue microarrays, TMAs）。
l 转录组和蛋白质组测序分析：对耐药细胞系及其对照细胞系进行转录组测序，筛选出差异表达基因（Differentially expressed genes, DEGs），通过火山图、韦恩图等分析工具，确定MASTL等关键基因在耐药细胞中的异常表达情况，初步揭示耐药相关的分子变化。
l 免疫共沉淀和质谱分析：利用免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱（MS）技术，鉴定与MASTL互作蛋白，进一步通过截短突变体构建等实验，明确MASTL 与YBX1的互作位点，为深入研究MASTL功能及其在耐药中的作用机制奠定基础。
l 染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）：通过 ChIP-seq 技术检测磷酸化YBX1在基因组上的结合位点，结合 RNA-seq数据，鉴定出PAK4是YBX1的关键转录靶基因，揭示MASTL通过YBX1调控PAK4表达的分子机制，为解析MASTL信号轴在耐药中的作用提供直接证据。
l 动物实验：建立裸鼠皮下移植瘤模型、原位肝癌模型以及患者来源异种移植瘤（PDX）模型，评估MASTL对HCC肿瘤生长和仑伐替尼耐药的作用，同时分析MASTL抑制剂MKI-1单独或联合仑伐替尼对肿瘤生长的抑制效果，为临床应用提供有力的实验依据。
结果图形
（1）整合转录组和蛋白质组分析揭示MASTL在仑伐替尼耐药HCC细胞系和组织中高表达
研究者们首先通过转录组和蛋白质组测序分析，比较分析了仑伐替尼耐药细胞系（PLC-R和97H-R）与对照细胞系（PLC-C和97H-C）的基因表达和蛋白表达差异。分析结果表明，在97H-R vs 97H-C细胞系、PLC-R vs PLC-C 细胞系以及临床耐药与敏感 HCC 组织样本之间，均存在大量差异表达基因。通过火山图筛选出符合特定条件（|log2FC|>1且p值<0.05）的DEGs，利用韦恩图分析发现7个在不同耐药细胞系和组织样本中均上调的基因，并鉴定出MASTL在多种癌症中与治疗耐药相关，且在本研究的耐药细胞系和组织样本中表达显著升高，进一步通过免疫组化（IHC）分析临床HCC组织样本，揭示MASTL高表达患者中仑伐替尼治疗耐药比例更高，表明MASTL与仑伐替尼耐药密切相关。
图1：整合转录组和蛋白质组分析揭示MASTL在仑伐替尼耐药的HCC细胞系和组织中高表达。
（A）不同浓度仑伐替尼耐药细胞系和对照细胞系中仑伐替尼的IC50值。
（B）经仑伐替尼处理的耐药细胞系和对照细胞系的集落形成实验（n=6）。
（C）经仑伐替尼处理后0、24、48、72和96小时，耐药细胞系和对照细胞系的细胞活性。
（D）在接受仑伐替尼治疗前被评估为疾病进展（PD）或部分缓解（PR）的患者的MRI图像。
（E）火山图显示在97H-R和97H-C细胞系的转录组和蛋白质组测序数据中鉴定的DEGs。
（F）火山图显示在PLC-R和PLC-C细胞系以及组织样本之间转录组测序数据中鉴定的DEGs。
（G）维恩图显示4个队列之间上调的DEGs重叠分析。
（H）热图显示维恩图中的重叠基因。
（I）免疫印迹和qRT-PCR检测在耐药细胞系、对照细胞系以及正常肝细胞系L02中相对MASTL表达。
（J）免疫组化显示在之前PR或PD的HCC组织样本中相对MASTL表达。
（K）TMA3中MASTL的免疫组化染色（左）。通过MASTL表达分析病例比例（右）。
（2）MASTL过表达与HCC患者不良预后相关
基于TCGA数据库分析，揭示MASTL在多种癌症类型（包括HCC）的肿瘤组织中表达高于正常组织。对HCC患者的预后分析表明，MASTL 高表达的患者总生存期（OS）更短，且在本研究收集的HCC样本中，MASTL表达与恶性表型和不良预后相关。多变量逻辑回归分析表明，MASTL过表达是 OS 和无病生存期（DFS）的独立预测因子，强调MASTL作为HCC预后标志物的潜力。
图2：MASTL过表达与HCC患者不良预后相关。
（A）与TCGA数据库中的正常组织相比，不同癌症类型中的MASTL表达水平。
（B）点图显示TCGA队列中50个原发性HCC样本和配对正常样本中MASTL的表达。
（C）分析TCGA数据库中HCC样本中MASTL的表达和患者的总生存期（OS）。
（D）qRT-PCR结果显示5个HCC样本和配对正常组织中MASTL的表达。
（E）通过点图定量的免疫印迹检测5个HCC和配对正常组织中MASTL的表达。
（F）TMA1和TMA2队列中H&E染色和MASTL染色的代表性图像。
（G）TMA1和TMA2队列中以IOD值表示的MASTL表达。
（H-I）基于TMA1和TMA2队列中MASTL表达的总生存期（OS）（H）和无病生存期（DFS）（I）曲线。
（J）区分HCC肿瘤和正常组织的AUROC值。
（K）热图显示按MASTL表达分组的270例HCC患者的临床病理特征。森林图显示通过单变量和多变量Cox比例风险回归分析确定的各种表征对OS和DFS的作用。所有实验至少重复3次。
（3）MASTL促进HCC细胞系对仑伐替尼耐药及体内外肿瘤进展
在多种 HCC 细胞系中检测 MASTL 表达水平，发现其在部分细胞系中表达较高。通过构建 MASTL 过表达和敲低的细胞模型，发现 MASTL 表达变化直接影响 HCC 细胞对仑伐替尼的敏感性（图 3C、D），且 MASTL 过表达增强了细胞的迁移、侵袭和自我更新能力，而敲低则抑制这些过程。在体外实验中，MASTL 过表达的 HCC 细胞形成的克隆数量增多，耐药性增强；而在体内皮下移植瘤模型中，MASTL 敲低显著抑制肿瘤生长和仑伐替尼耐药，过表达则相反（图 3E-H）。此外，RNA 测序分析显示 MASTL 过表达激活了 MAPK 信号通路（图 3I、J），表明 MASTL 可能通过调节该通路促进 HCC 肿瘤进展和耐药。
图3：MASTL促进HCC细胞对仑伐替尼耐药及体内外进展。
（A）免疫印迹（上图）和qRT-PCR（下图）结果展示不同HCC细胞系中相对的MASTL表达。
（B）免疫印迹和qRT-PCR结果展示MHCC97H细胞中MASTL过表达以及SNU449细胞中MASTL敲低的效率。
（C）MASTL过表达、MASTL敲低和对照细胞系中仑伐替尼的IC50值。
（D）MASTL过表达、MASTL敲低和对照细胞系用仑伐替尼处理的集落形成实验。
（E–H）使用指定细胞建立皮下肿瘤模型，小鼠接受仑伐替尼或安慰剂治疗（n=6）。在指定时间点检测肿瘤体积，终点时测量肿瘤重量。
（I）气泡图显示MASTL过表达细胞系的KEGG通路分析结果。
（J）免疫印迹分析显示指定细胞系中MAPK信号通路的激活。
（K）气泡图显示MASTL过表达细胞系的GO：BP分析结果。
