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2025年11月24日，安徽医科大学/深圳市第二人民医院徐亚运、安徽医科大学柳文强为共同第一作者，安徽医科大学/深圳市第二人民医院徐亚运、安徽医科大学陈飞虎教授为共同通讯作者，在《INT J BIOL MACROMOL》（IJBM)期刊发表题为“H3K18la-driven methyltransferase 1-mediated upregulation of NeuroD1 m⁷G modification in promoting ferroptosis resistance in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts”的科研成果。研究揭示了代谢-表观遗传-RNA修饰三级调控轴在类风湿关节炎（RA）滑膜成纤维细胞（RASFs）异常增殖中的核心作用。

研究团队发现，RA患者滑液中堆积的乳酸通过组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）修饰激活甲基转移酶METTL1转录；而METTL1介导的m⁷G RNA甲基化增强了转录因子NeuroD1的mRNA稳定性，进而上调铁死亡关键抑制因子GPX4表达，导致RASFs铁死亡抵抗，最终促进其异常增殖，加剧RA患者关节破坏。该研究整合了代谢组学、表观组学（ChIP-seq、m⁷G MeRIP-seq）、转录组学（RNA-seq）等多组学技术，在胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型中验证了靶向METTL1/NeuroD1轴的治疗潜力，为RA的精准干预提供了新的分子靶点和理论依据。易基因科技为本研究提供的m⁷G MeRIP-seq和RNA-seq技术服务支撑，助力揭示了METTL1通过m⁷G修饰调控NeuroD1稳定性的直接分子机制。

英文标题：H3K18la-driven methyltransferase 1-mediated upregulation of NeuroD1 m⁷G modification in promoting ferroptosis resistance in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts

中文标题：H3K18乳酸化驱动METTL1介导的NeuroD1 m⁷G修饰上调促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞铁死亡抵抗

发表时间：2025-11-24

发表期刊：《International Journal of Biological Macromolecules》（IJBM)

影响因子：IF8.5/Q1

技术平台：代谢组学、ChIP-seq、m⁷G MeRIP-seq、RNA-seq（易基因金牌技术）

作者单位：安徽医科大学、深圳市第二人民医院

DOI:10.1016/j.ijbiomac.2025.149196

图形摘要：示意图展示H3K18乳酰化如何诱导METTL1介导的NeuroD1 m⁷G修饰上调，从而增强铁死亡抵抗并促进RASF增殖

 

易小结

本研究将代谢产物（乳酸）、组蛋白修饰（组蛋白乳酸化）、RNA修饰（m⁷G甲基化）和铁细胞死亡在RA病理中串联起来，构建了一个全新的致病通路。提出了通过局部干预靶向异常代谢-表观遗传环路，可能实现精准治疗并减少全身副作用的新思路。

研究成功运用代谢组、ChIP-seq、RNA-seq、MeRIP-seq等易基因多组学技术进行机制挖掘，为复杂疾病机制研究提供了思路，凸显了多组学联用在解析RNA修饰功能中的强大能力，为后续类似研究提供了方法学参考。

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研究方法

（1）临床样本与细胞模型

—   样本来源：30例RA患者及30例年龄性别匹配的外伤对照，获取关节滑液和滑膜组织；另取6例RA与6例对照进行非靶向代谢组学分析。

—   原代细胞：提取原代RASFs和正常滑膜成纤维细胞（NSFs），使用3-6代细胞进行实验。

（2）功能学实验

—   增殖能力：CCK-8法和EdU染色检测细胞增殖。

—   铁死亡评估：检测线粒体膜电位、脂质活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）水平，并通过透射电镜观察线粒体形态。

—   双荧光素酶报告基因实验：验证NeuroD1对GPX4启动子的转录激活作用。

（3）分子机制探索

—   ChIP-seq：使用抗H3K18la抗体富集与H3K18la修饰结合的DNA片段，进行测序分析，鉴定下游靶基因（如METTL1）。ChIP-qPCR定量验证H3K18la在特定基因（如METTL1）启动子区的富集。

—   m⁷G甲基化MeRIP-seq：全转录组水平鉴定m⁷G修饰位点及差异修饰基因。m⁷G RIP-qPCR定量检测特定RNA（如NeuroD1 mRNA）上的m⁷G修饰水平。

—   MeRIP-seq+RNA-seq：将RASFs与NSFs的MeRIP-seq数据与mRNA-seq数据关联分析，筛选出在RASFs中同时发生高m⁷G修饰且高表达的基因，从而锁定关键下游靶点NeuroD1。

（4）动物模型验证

—   使用DBA/1小鼠构建胶原诱导性关节炎（CIA）模型。

—   通过关节内注射携带shMETTL1或shNeuroD1的慢病毒进行局部基因敲低。

—   评估关节炎指数、体重变化，并进行关节组织的H&E、甲苯胺蓝、SO/FG染色及免疫组化分析，评估治疗效果。

 

结果图形

（1）类风湿关节炎（RA）患者滑液中堆积的乳酸促进滑膜成纤维细胞（RASFs）增殖

研究首先在临床样本中验证了RA滑膜微环境特征。非靶向代谢组学分析显示，RA患者滑膜液中乳酸水平显著高于关节创伤对照组（图1A-B）。体外实验显示，10 mmol/L乳酸刺激可显著增强RASFs增殖能力，CCK-8检测显示24-96小时存活率持续提升（图1C），EdU阳性率从约15%上升至35%（图1D-E）。

同时，研究发现在RA患者和CIA小鼠模型的滑膜组织中，整体蛋白乳酸化（Pan-Kla）和特异的组蛋白H3K18la水平均显著上调（图1F-K）。细胞水平，RASFs中的H3K18la水平也高于正常对照NSFs，并且外源性乳酸刺激能进一步诱导RASFs中H3K18la表达（图1L-P），证实乳酸可直接驱动组蛋白乳酸化修饰。这一结果确立了乳酸作为RA微环境中关键代谢信号分子，通过表观遗传重编程调控RASFs病理行为的起始环节。

图1：RA患者滑液中升高的乳酸水平促进RASFs增殖。

 

（2）乳酸通过H3K18la修饰促进RASFs增殖，而METTL1是H3K18la的下游靶基因

为验证H3K18la的功能，采用siRNA敲低乳酸化writer酶P300，发现H3K18la可逆转乳酸诱导的RASFs增殖（图2A-C），证明H3K18la是乳酸促增殖效应的关键介质。为筛选H3K18la调控的下游基因，研究者对RASFs进行了H3K18la的ChIP-seq测序，并与RA滑膜组织差异表达RNA-seq结果进行相关性分析，筛选出8个候选基因（图2D-E）。

进一步乳酸刺激后，METTL1 mRNA上调最显著（图2F）。临床样本相关性分析显示，RA滑膜中METTL1表达与H3K18la水平呈正相关（图2G）。ChIP-qPCR证实H3K18la在METTL1启动子区显著富集，而抑制P300可降低这种富集（图2H）。

通过CRISPR-dCas9系统，靶向招募P300至METTL1启动子可特异性增强H3K18la修饰（图2I），而招募KRAB抑制结构域则降低修饰水平（图2J）。P300敲低同时阻断乳酸诱导的METTL1蛋白上调（图2K-L）。上述结果共同表明，乳酸诱导的H3K18la通过直接结合并激活METTL1的启动子，上调其表达。

图2：乳酸通过H3K18la修饰促进RASFs增殖

 

（3）沉默METTL1抑制滑膜成纤维细胞（RASFs）增殖

在确认METTL1是H3K18la的下游靶点后，研究探究了METTL1在RA中的表达和功能。结果显示，与对照组相比，RA患者和CIA小鼠的滑膜组织中，整体m⁷G修饰水平和METTL1蛋白表达均显著升高（图3A-E）。在细胞水平，RASFs中的METTL1 mRNA和蛋白水平也高于NSFs（图3F-H）。功能上，使用siRNA敲低METTL1后（图3I-J），RASFs的增殖能力被显著抑制（图3K-M）。该结果证实METTL1介导的m⁷G修饰是维持RASFs快速增殖的关键调控因子，且该效应不依赖于乳酸刺激。

图3：METTL1沉默对RASFs增殖的功能作用

 

（4）METTL1沉默消除乳酸诱导的铁死亡抑制并进一步减少RASFs增殖

为探索METTL1促增殖的下游机制，研究者对RA与对照滑膜组织进行了mRNA-seq，鉴定出2118个差异表达基因（1,146上调/972下调）（图4A），并通过GSEA分析发现，METTL1低表达与铁死亡相关基因集富集相关（图4B），提示METTL1可能抑制铁死亡。

已知铁死亡是RASFs的一种潜在死亡方式。Erastin诱导实验证实，乳酸预处理可逆转铁死亡特征（脂质过氧化、ROS升高、线粒体萎缩），而METTL1敲低则恢复细胞对铁死亡的敏感性：线粒体膜电位下降（图4C-D）、MDA水平回升（图4E）、脂质ROS增加（图4F）、电镜显示线粒体出现典型铁死亡形态（图4G）。功能上，METTL1沉默不仅阻断乳酸的促增殖作用，反而使RASFs生长速率低于基础水平（图4H-J），这表明METTL1介导了乳酸赋予RASFs的铁死亡抵抗性，从而支持其持续增殖。该结果将METTL1功能从转录后调控延伸至细胞死亡方式调控，揭示了代谢-表观遗传-细胞命运交叉调控的新角度。

图4：沉默METTL1对乳酸刺激的RASFs铁死亡和增殖的作用

 

（5）NeuroD1是RASFs中METTL1介导的m⁷G修饰靶基因

研究人员对RASFs和NSFs进行了m⁷G MeRIP-seq与RNA-seq联合分析（图5A），共筛选鉴定出7个高甲基化且高表达的候选基因（图5B）。在扩大临床样本中验证后，NeuroD1的m⁷G修饰水平和mRNA表达上调最显著（图5C-D）。m⁷G RIP-qPCR显示，敲低METTL1能显著降低NeuroD1 mRNA上的m⁷G修饰水平（图5E），同时，METTL1敲低也降低了NeuroD1的mRNA和蛋白表达（图5F）。

双荧光素酶报告基因实验构建NeuroD1 5'UTR野生型与m⁷G motif突变体质粒，证实METTL1直接调控其修饰（图5G-H）。RNA稳定性实验和MS2拴系实验进一步证明，METTL1通过其m⁷G甲基转移酶活性（而非催化失活突变体）来增强NeuroD1 mRNA稳定性（图5I，J）。

临床样本也证实NeuroD1在RA患者和CIA小鼠滑膜组织中高表达（图5K-M），RASFs中表达显著高于NSFs（图5N-O）。生物信息学分析预测NeuroD1可能调控多个铁死亡相关基因，实验验证敲低NeuroD1能显著下调GPX4的表达（图5P-Q）。最后，通过构建不同长度的GPX4启动子报告基因，证实NeuroD1能直接结合并转录激活GPX4启动子（图5R-T）。上述结果通过MeRIP-seq技术精确锁定NeuroD1为METTL1下游效应分子，阐明了m⁷G修饰通过增强mRNA稳定性调控转录因子表达的分子机制。

图5：NeuroD1是RASFs中METTL1依赖的m⁷G甲基化底物

 

（6）NeuroD1过表达部分逆转METTL1沉默对铁死亡和RASFs增殖的抑制效应

为验证NeuroD1是否介导METTL1功能，在METTL1敲低基础上过表达NeuroD1。挽救实验显示，NeuroD1过表达可恢复线粒体膜电位（图6A-B）、降低MDA和ROS水平（图6C-D）、改善线粒体形态异常（图6E），表明其可以部分挽救因METTL1缺失导致的铁死亡。

增殖功能方面，NeuroD1过表达使METTL1沉默细胞的生长速率回升30%（图6F），EdU阳性率从10%恢复至22%（图6G-H）。该结果证实NeuroD1是METTL1-m⁷G轴的关键调控因子，位于METTL1下游调控铁死亡抵抗和细胞增殖，构成完整的"METTL1→NeuroD1→GPX4"信号链。

图6：NeuroD1过表达部分逆转了METTL1沉默对铁凋亡和RASF增殖的作用

 

（7）局部敲低METTL1或NeuroD1减轻CIA模型关节炎严重程度

最后研究在CIA小鼠模型中进行了体内功能验证。通过关节内注射携带shMETTL1/shNeuroD1慢病毒（图7A），局部敲低这两个基因。结果显示，与对照组相比，敲低METTL1或NeuroD1小鼠体重下降趋势缓解，且能显著改善小鼠的关节炎临床评分（图7B-C）。组织学染色显示，处理组的关节滑膜增生、炎症浸润和软骨破坏等病理变化显著减轻（图7D-H）。免疫组化分析显示，处理组关节滑膜中H3K18la、METTL1、NeuroD1和GPX4的表达也相应降低（图7I-L）。其疗效与阳性药物甲氨蝶呤（MTX）相当。这有力证明了靶向“乳酸-H3K18la-METTL1-NeuroD1”轴在体内具有治疗RA的潜力，局部干预即可产生系统性关节炎改善效果。

图7：关节内注射METTL1或NeuroD1 shRNA对CIA小鼠关节炎严重程度的作用

 

结论和启示

本研究揭示，RA滑膜微环境中积累的乳酸，通过诱导H3K18la修饰上调METTL1表达，METTL1进而介导NeuroD1 mRNA的m⁷G修饰并增强其稳定性，导致NeuroD1蛋白积累。进一步，NeuroD1作为转录因子激活GPX4表达，抑制脂质过氧化，最终介导RASFs铁死亡抵抗性，促进其异常增殖和RA进展。

m⁷G MeRIP-seq与多组学数据整合策略，绘制了RASFs中m⁷G修饰图谱，并与ChIP-seq（H3K18la）、RNA-seq进行多组学关联分析，从"染色质状态-修饰靶标-表达变化"角度验证METTL1-NeuroD1轴。这种多组学交叉验证策略显著提高了靶点筛选的可靠性，避免了单一组学可能产生的假阳性，展现了表观多组学研究在解析复杂疾病调控网络中的独特优势。

参考文献：

Xu Y, Liu W, Zai Z, Qian X, Hu W, Peng X, Chen F. METTL3 increases ferroptosis resistance to facilitate the tumor-like features of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through enhancing SLC7A11 mRNA stability in an m6A-IGF2BP2-dependent manner. Int J Biol Macromol. 2025 Jul 5:145698. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2025.145698.