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近日，中山大学附属口腔医院陆云洋博士、李润泽博士、杜维东博士为共同第一作者，余东升教授、赵玮教授为共同通讯作者，在Nature子刊《Cell Death & Disease》发表题为“NSUN2 mediated-aberrant 5-methylcytosine methylation regulates autophagy-related ferroptosis in oral squamous cell carcinoma progression”的研究论文。研究系统阐明了RNA甲基转移酶NSUN2通过m5C甲基化修饰调控口腔鳞状细胞癌（OSCC）铁死亡（Ferroptosis）抗性的分子机制。
研究发现，NSUN2在OSCC中显著高表达（异常），且与患者不良预后相关。NSUN2通过催化自噬受体蛋白SQSTM1/P62 mRNA m5C甲基化，招募reader蛋白YBX1维持mRNA稳定性，从而上调P62蛋白水平，进而抑制其自噬依赖的铁死亡过程，最终导致OSCC细胞获得铁死亡抵抗性，促进肿瘤增殖、迁移和侵袭。该研究不仅阐明了“NSUN2-YBX1-SQSTM1/P62”轴调控自噬相关铁死亡的新机制，也为靶向表观转录组以克服OSCC治疗耐药提供潜在新靶点。易基因科技为本研究提供m5C甲基化测序（RNA-Bis-seq）和转录组测序（RNA-seq），助力揭示NSUN2通过5-甲基胞嘧啶调控自噬依赖性铁死亡促进口腔鳞癌进展。
英文标题：NSUN2 mediated-aberrant 5-methylcytosine methylation regulates autophagy-related ferroptosis in oral squamous cell carcinoma progression
中文标题：NSUN2通过5-甲基胞嘧啶调控自噬依赖性铁死亡促进口腔鳞癌进展
发表时间：2025-12-23
发表期刊：Cell Death & Disease
影响因子：IF9.6/Q1
技术平台：m5C-Bis-seq、mRNA-seq（易基因金牌技术）
作者单位：中山大学附属口腔医院
DOI:10.1038/s41419-025-08174-y
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是一类转移率高、预后较差的常见恶性肿瘤。本研究探讨了m5C甲基转移酶NSUN2及m5C甲基化在OSCC进展中的作用，尤其是与铁死亡抗性的关系。研究结果显示，NSUN2在OSCC组织和细胞系中显著过表达，其高表达与不良预后及侵袭性肿瘤表征相关。在铁死亡抗性OSCC细胞中敲低NSUN2可增强铁死亡敏感性；相反，NSUN2过表达则促进铁死亡抗性，即使在erastin处理下也能减少铁积累并恢复GPX4表达。
具体而言，NSUN2介导自噬受体蛋白1（SQSTM1）/P62 mRNA的m5C修饰，而m5C reader蛋白Y盒结合蛋白1（YBX1）可增强SQSTM1/P62 mRNA的稳定性，进而通过调控抑制自噬以抑制OSCC中的自噬依赖性铁死亡。此外，体内异种移植模型证实，NSUN2敲低显著抑制肿瘤发生。值得注意的是，使用自噬抑制剂（3-MA）或铁死亡抑制剂（Fer-1）处理可部分恢复NSUN2敲低细胞的肿瘤生长，验证自噬和铁死亡在NSUN2介导的OSCC进展中的关键作用。本研究结果将NSUN2-YBX1-SQSTM1/P62轴确定为OSCC中自噬依赖性铁死亡的关键调控因子，揭示了NSUN2作为增强OSCC铁死亡诱导的相关表观转录组学靶点的广泛前景。
图形摘要
易小结
本研究将m5C修饰、细胞自噬与铁死亡三大前沿领域巧妙联结，突破了传统研究对DNA甲基化和组蛋白修饰的单一关注，揭示了一条从甲基化添加、识别到下游功能蛋白稳定性的完整信号轴，为理解肿瘤的复杂适应性提供了多维视角。
易基因科技提供的m5C-Bis-Seq测序技术实现了单碱基分辨率下的RNA m5C修饰图谱绘制，在此类机制探索中发挥了关键作用，是肿瘤研究从基因组学向转录后修饰组学的深度拓展。
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研究方法
（1）临床与公共数据分析：OSCC临床样本，结合TCGA、GTEx等公共数据库，分析NSUN2的表达与预后关联。利用scRNA-seq数据（GSE172577）解析NSUN2在肿瘤微环境细胞亚群中的表达。
（2）细胞功能实验：在多种OSCC细胞系（HSC6/SCC9）中，通过慢病毒/shRNA敲低或过表达NSUN2，利用CCK-8、克隆形成、Transwell迁移/侵袭实验评估其对细胞增殖、迁移、侵袭能力的作用。
（3）铁死亡与自噬表型检测：使用Erastin（铁死亡诱导剂）处理细胞
Western Blot检测铁死亡标志物（GPX4, ACSL4, Transferrin）和自噬标志物（P62, LC3, ATG5, BECN1）。
流式细胞术检测脂质过氧化（C11 BODIPY探针）。
荧光探针检测细胞内Fe2+（FerroOrange）和活性氧（ROS）。
（4）分子机制研究探索：
全局m5C水平检测：使用Dot Blot和比色法检测细胞整体m5C甲基化水平。
m5C-Bis-Seq：对对照组和NSUN2敲低组的细胞进行全转录组m5C甲基化测序，筛选出差异甲基化的m5C位点。
mRNA-Seq：平行进行转录组测序，获得差异表达基因。
综合分析：将m5C-Bis-Seq发现的差异甲基化基因与mRNA-Seq的差异表达基因、以及自噬相关基因集进行交集分析，从而精确定位到既是NSUN2下游m5C修饰靶点，又参与自噬调控的关键基因SQSTM1/P62。
（5）验证实验：
分子对接与动态模拟：预测NSUN2蛋白与SQSTM1/P62 mRNA的潜在结合。
MeRIP-qPCR（m5C-RIP）：验证SQSTM1/P62 mRNA上特定位点（如Site 3）的m5C修饰，并证实该修饰依赖于NSUN2。
RIP-qPCR：验证YBX1与SQSTM1/P62 mRNA结合，并证明该结合受NSUN2调控。
RNA稳定性实验：qRT-PCR证明NSUN2或YBX1过表达能延长SQSTM1/P62 mRNA的半衰期，而突变其m5C位点则抑制此效应。
体内功能验证：构建裸鼠皮下移植瘤模型，分组注射对照细胞、NSUN2敲低细胞、以及敲低细胞联合自噬抑制剂（3-MA）或铁死亡抑制剂（Fer-1），观察肿瘤生长，并通过免疫组化/免疫荧光验证相关蛋白表达。
结果图形
（1）NSUN2在OSCC组织和细胞中高表达并与不良预后相关
通过对TCGA等数据库分析，本研究发现NSUN2在包括头颈鳞癌（HNSC）在内的多种肿瘤组织中表达上调。在OSCC队列中，NSUN2 mRNA在肿瘤组织中的水平显著高于癌旁正常组织。单细胞转录组分析进一步揭示，NSUN2及其reader蛋白YBX1在恶性上皮细胞中特异性富集（图1C-D）。生存分析表明，NSUN2高表达的OSCC患者总生存期更差，多因素Cox回归证实NSUN2是独立的预后不良因素（图1F）。在蛋白水平上，Western Blot证实NSUN2在OSCC临床样本（图1H-I）及部分细胞系（HSC6/SCC9）中高表达（图1J-K）。转录组差异表达基因的GO富集分析提示，NSUN2高表达与金属离子转运、氧化磷酸化、脂质氧化等铁死亡相关通路相关（图1L-N）。这些结果表明NSUN2是OSCC发生发展的关键因子。
图1：NSUN2过表达与OSCC转录组重塑及不良预后相关
（2）敲低NSUN2抑制OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭
为确定NSUN2在OSCC细胞系中的生物学功能，研究者在NSUN2高表达的HSC6和SCC9细胞系中，利用shRNA稳定敲低NSUN2（图2A-C）后，细胞增殖能力（CCK-8实验）（图2D）、迁移和侵袭能力（Transwell实验）（图2E-I）以及克隆形成能力（图2J-K）均被显著抑制。上述功能实验表明NSUN2是维持OSCC恶性表型的关键驱动因子。
图2：体外实验中，NSUN2敲低显著抑制OSCC细胞的侵袭、迁移和增殖
（3）敲低NSUN2增强OSCC细胞铁死亡敏感性，而过表达NSUN2则赋予铁死亡抗性
在SCC9和HSC6两种NSUN2高表达细胞系中，研究者进一步探讨NSUN2敲低是否调控铁死亡敏感性。在铁死亡诱导剂Erastin处理后，NSUN2敲低细胞中NSUN2 mRNA水平降低50%，而对照组无变化（图3A）。Western blot显示NSUN2敲低降低了铁死亡标志物GPX4和Transferrin表达，同时增加了ACSL4和SLC11A2表达，且在erastin处理后更显著（图3B-C）。此外，shNSUN2转染显著增加erastin处理细胞的脂质过氧化水平（图3D-E）。透射电镜（TEM）进一步揭示NSUN2敲低OSCC细胞呈现特征性铁死亡形态学变化，如线粒体体积缩小、膜密度增加，且随erastin处理更加显著（图3F）。
而通过OE-NSUN2质粒过表达NSUN2，Western blot证实即使在erastin存在下，NSUN2过表达仍显著升高NSUN2和GPX4水平，同时降低ACSL4表达（图3G-H）。与此一致，FerroOrange探针免疫荧光染色显示，NSUN2过表达细胞即使在erastin处理后，铁积累也显著低于对照细胞（图3H-I）。上述研究结果表明NSUN2是介导OSCC铁死亡抗性的关键因子，其抑制可增强癌细胞对铁死亡诱导的敏感性。
图3：NSUN2的敲低和过表达调控OSCC细胞的铁死亡敏感性
（4）NSUN2通过m5C依赖性稳定SQSTM1/P62 mRNA来介导OSCC铁死亡抗性
为探究NSUN2如何以m5C依赖性方式调控铁死亡，研究者对NSUN2敲低细胞和对照细胞进行了m5C-Bis-Seq和mRNA-Seq。生物信息学分析发现，差异甲基化m5C基因显著富集在自噬通路（图4D）。将m5C-Bis-Seq的差异甲基化基因、mRNA-Seq的差异表达基因与自噬相关基因集进行交集分析，成功鉴定出自噬受体蛋白SQSTM1/P62及其m5C修饰位点是NSUN2的重要下游靶标（图4E-F）。研究者基于m5C-Bis-Seq数据和NSUN2底物偏好（CG富集基序和CNGGG序列）在SQSTM1/P62 mRNA上鉴定出4个候选m5C位点：Site1（chr5:179821023）、Site2（chr5:179821058）、Site3（chr5:179822965）和Site4（chr5:179833164）。分子对接模拟证实NSUN2与SQSTM1/P62 mRNA结合形成稳定复合体（图4G）。
为验证这些位点的功能相关性，研究者构建C→T突变（Sites1-4）并检测其作用（图4H）。MeRIP-qPCR实验证实SQSTM1/P62 mRNA（尤其Site 3区域）存在m5C修饰，且该修饰在NSUN2敲低后显著减少（图4I、K、L）。RNA稳定性实验证明，NSUN2过表达能延长野生型SQSTM1/P62 mRNA半衰期，而将其m5C位点突变（C→T）后，这种稳定性消失（图4J）。以上实验为NSUN2通过m5C甲基化直接靶向SQSTM1/P62 mRNA并稳定其表达提供了有力证据。
m5C-Bis-Seq在此起到了决定性作用，绘制的单碱基分辨率RNA甲基化图谱，帮助研究者从全转录组范围内筛选并定位到功能相关的特异性m5C修饰靶点，将NSUN2的酶活功能与SQSTM1/P62的转录后调控直接联系起来。
图4：NSUN2增加SQSTM1/P62 mRNA m5C修饰和稳定性，以m5C依赖性方式调控OSCC自噬
A. SCC9、HSC6、SCC15、HSC3、CAL27、SAS和UM1细胞系暴露于指定剂量的erastin 24小时后，通过CCK8实验评估细胞活力。
B. erastin处理后各细胞系的m5C水平。
C. Dot Blot检测稳定敲低NSUN2细胞中RNA m5C低甲基化变化。
D. 通过RNA-seq分析OSCC中与铁死亡相关的差异表达m5C基因。经KEGG分析后，显示实验组与对照组相比差异甲基化胞嘧啶（DMC）修饰基因所富集的通路。
E. 自噬通路基因、m5C-seq（RNA-Bis-seq）和RNA-seq的erastin下游靶标交集韦恩图。
F. 经erastin处理或未经处理的细胞系中SQSTM1/P62 mRNA m5C位点。
G. NSUN2与SQSTM1/P62 mRNA的分子对接分析。
H. 构建携带野生型或突变型（C→T突变）m5C位点质粒模式图。
I. 将上述构建的质粒转染至稳定过表达NSUN2的细胞中，通过MeRIP-qPCR评估HSC6细胞中SQSTM1/P62 mRNA的m5C修饰。
J. 经放线菌素D处理终止转录后，野生型或突变型SQSTM1/P62 HSC6细胞中SQSTM1/P62 mRNA的残留水平。
K-L. 转染shNSUN2或shCtrl的HSC6细胞中，SQSTM1/P62 mRNA的富集情况。
（5）YBX1通过增强NSUN2依赖性SQSTM1/P62 mRNA稳定性以介导OSCC铁死亡抵抗性
为系统理解异常m5C高甲基化在铁死亡抗性中的作用，研究者进一步探讨m5C reader蛋白YBX1的功能。Western blot显示YBX1在某些OSCC细胞系（HSC6和SCC9）中显著高于NOK细胞，其他细胞系无显著变化（图5A-B）。敲低效率经Western blot和qRT-PCR验证（图5C-F）。与NSUN2敲低类似，YBX1沉默同时增加脂质过氧化（图5G-H），显著降低erastin处理细胞的GSH/GSSG比值（图5I-J），并升高ROS水平（图5K-L）。RIP-PCR显示NSUN2敲低导致YBX1对SQSTM1/P62 mRNA的富集显著降低（图5M）。
为评估YBX1对SQSTM1/P62 mRNA稳定性的影响，研究者用RNA合成抑制剂放线菌素D处理YBX1过表达细胞，结果显示YBX1过表达增强SQSTM1/P62 mRNA稳定性（图5N）。这些发现表明YBX1沉默不仅诱导铁死亡，还增强既往抗性OSCC细胞的铁死亡诱导剂响应，揭示了YBX1在维持铁死亡抗性中的关键作用。以上研究结果表明，NSUN2通过m5C修饰调控SQSTM1/P62表达和稳定性，而YBX1作为reader蛋白识别m5C标记并维持mRNA稳定性。
图5：m5C reader蛋白YBX1是铁死亡抗性所必需的
（6）NSUN2介导的SQSTM1/P62上调抑制自噬和铁死亡抵抗性
前述结果鉴定出SQSTM1/P62是NSUN2介导m5C甲基化的重要下游靶标，NSUN2通过稳定SQSTM1/P62 mRNA维持其表达。研究人员进一步分析NSUN2-YBX1-P62轴如何影响自噬与铁死亡。分析结果发现，NSUN2敲低导致P62蛋白下调，同时自噬标志物ATG5、BECN1表达上调，LC3-II/I比值增加，表明自噬被激活；而自噬抑制剂3-MA能逆转这些变化（图6A-F）。透射电镜观察到NSUN2敲低后自噬体数量增多，3-MA处理则减少（图6G-H）。mRFP-GFP-LC3双标实验也证实NSUN2敲低促进自噬（图6I）。更重要的是，NSUN2敲低引起的细胞内铁积累可被3-MA抑制（图6J），直接将NSUN2下调→自噬激活→铁死亡敏感性增加这条通路串联起来，证明NSUN2通过抑制自噬抵抗铁死亡。
图6：NSUN2介导的SQSTM1/P62上调导致OSCC中自噬抑制及随后的铁死亡抗性
（7）敲低NSUN2通过自噬依赖性铁死亡抑制OSCC体内肿瘤发生
研究人员在体内实验最终验证了NSUN2-自噬-铁死亡调控轴的生理相关性（图7A）。在裸鼠移植瘤模型中，NSUN2敲低显著抑制肿瘤生长，而同时给予自噬抑制剂3-MA或铁死亡抑制剂Fer-1，都能部分恢复NSUN2敲低组的肿瘤生长，表明自噬和铁死亡对NSUN2缺失诱导的肿瘤抑制至关重要（图7B-E）。
肿瘤组织的免疫组化显示，NSUN2敲低后细胞增殖标志Ki67减少，且与P62表达呈正相关，但经3-MA或Fer-1处理后恢复（图7F-G）。上述体内实验结果验证了体外发现，强调NSUN2-SQSTM1/P62轴通过调控自噬和铁死亡促进OSCC肿瘤生长的关键作用。
图7：3-MA或Fer-1处理可以部分挽救NSUN2在体内敲低抑制的肿瘤发生
结论和启示
本研究通过RNA-Bis-seq、mRNA-seq及体内外实验揭示了NSUN2在OSCC中高表达，通过催化SQSTM1/P62 mRNA的m5C修饰，并招募YBX1增强其稳定性，导致P62蛋白累积。接着，P62高表达抑制细胞自噬，进而抑制自噬依赖性铁死亡通路，最终促进OSCC进展和治疗抵抗性。NSUN2-YBX1-SQSTM1/P62轴是调控OSCC中自噬相关铁死亡的关键通路。
m5C-Bis-Seq在本研究中的重要作用
本研究中m5C-Bis-Seq技术是NSUN2功能机制研究的核心工具，提供了单碱基分辨率的全转录组m5C修饰图谱。
发现关键靶点：将表型（铁死亡抵抗）与特定的m5C修饰变化关联，通过组学交集分析锁定SQSTM1/P62。
精确定位修饰位点：明确SQSTM1/P62 mRNA上具体的m5C修饰位点，为后续的位点突变验证提供精确坐标。
建立因果链：将甲基转移酶（NSUN2）、修饰位点（m5C）、reader蛋白（YBX1）、mRNA稳定性、蛋白表达及最终细胞功能（自噬/铁死亡）串联成一个完整、严谨的分子机制通路。
关于易基因RNA m5C甲基化测序(RNA-BS)技术
m5C是RNA百余种修饰中研究较多的一种。m5C存在于tRNA上时，可以对翻译进行调节；存在于rRNA上时，可以对核糖体的生物合成进行质控；存在于mRNA上时，则可以影响mRNA的结构、稳定性及翻译过程。
易基因提供适用于不同科研需求的m5C甲基化测序技术：
◇ 常规mRNA m5C甲基化测序（RNA-BS）：
mRNA分离后首先通过亚硫酸盐处理，非甲基化的C转变为U，m5C修饰的碱基保持不变，结合高通量测序，可以对RNA上的每一个C碱基修饰进行定位与定量。
◇ 常规mRNA +lncRNA m5C甲基化测序（全转录组RNA-BS）：
易基因科技建立的升级版m5C RNA甲基化测序服务，去除人rRNA后，剩余RNA经重亚硫酸盐处理后，结合高通量NGS策略，可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。
技术优势：
l 高深度：超高深度重亚硫酸盐处理，检测准确性极高；
l 高通量：结合高通量NGS，全转录组范围内检测；
l 单碱基：单碱基分辨率，快速检测和分析RNA中的m5C。
l 高准确：精确的检测mRNA等每一个C碱基的的修饰水平。
研究方向：
Ø 与m6A甲基化类似，m5C甲基化已被证明与肿瘤、神经系统紊乱、代谢性疾病、病毒感染以及个体发育等密切相关。
Ø 此外，RNA甲基化（m5C）与人类疾病密切相关，其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。
参考文献：Lu Y, Li R, Du W, Wu J, He Y, Yuan L, Chen X, Lv S, Shi F, Hu J, Zhao W, Yu D. NSUN2 mediated-aberrant 5-methylcytosine methylation regulates autophagy-related ferroptosis in oral squamous cell carcinoma progression. Cell Death Dis. 2025 Dec 23;16(1):903. doi: 10.1038/s41419-025-08174-y.
