2025年，新疆农业大学动物科学学院王旭光副教授团队聚焦于解决卵母细胞玻璃化冷冻保存损伤难题，在《Antioxidants》（IF6.6/Q2）期刊发表题为“Spermidine Supplementation Effectively Improves the Quality of Mouse Oocytes After Vitrification Freezing”（亚精胺补充可有效改善玻璃化冷冻保存的小鼠卵母细胞质量）的科研成果。卵母细胞因其体积大、含水量高、单细胞状态及特异性染色体构型等特点，在冷冻过程中表现出显著的氧化应激损伤和细胞器损伤（organelle damage），导致受精能力和生育力下降。
研究主要探索了卵母细胞玻璃化冷冻过程中补充亚精胺（Spermidine,Spd）（一种多胺类化合物）的保护作用。研究结果表明，在冷冻液中补充50 μmol/L亚精胺能显著提高冷冻后小鼠卵母细胞的存活率、体外受精后的囊胚形成率，并通过一系列实验系统揭示亚精胺通过缓解氧化应激、修复线粒体功能、改善内质网（ER）分布、调节纺锤体形态及钙稳态等多重机制，有效提升冷冻卵母细胞质量。该研究不仅为卵母细胞冷冻保存技术优化提供新策略，更通过单细胞转录组测序技术深入揭示亚精胺的分子保护机制，具有重要的理论价值和应用前景。易基因科技为本研究提供单细胞转录组测序（Smart-seq2）技术服务，助力揭示亚精胺提升玻璃化冷冻小鼠卵母细胞质量的保护机制。
本研究揭示亚精胺能够显著提高卵母细胞玻璃化冷冻后的存活率（92% ±4% vs 82%±3%）以及冷冻后体外受精的囊胚形成率（14.86%±7% vs 6%±3）。具体而言，补充亚精胺可挽救47.3%的关键失调通路，包括卵巢类固醇生成通路，并使43.3%的异常表达基因恢复正常表达水平。后续研究进一步阐明，亚精胺能够有效挽救玻璃化后的线粒体功能障碍、缓解氧化应激损伤，并调节细胞内钙稳态。本研究结果表明，在玻璃化冷冻过程中补充亚精胺是一种保护卵母细胞免受低温损伤的有效方法。
易小结
本研究首次系统阐明了亚精胺作为冷冻保护补充剂的多重生物学功能，不仅揭示多胺类化合物在卵母细胞冷冻生物学中的重要作用，更为开发高效、低毒的冷冻保护系统提供理论依据。
本研究采用Smart-seq2单细胞转录组测序技术（易基因金牌技术），实现对单细胞水平基因表达变化的精准检测，突破传统bulk RNA-seq在稀有样本分析中的局限，为深入解析冷冻损伤的分子机制和调控网络提供高分辨率数据支撑，为未来揭示低温损伤的核心机制提供强大工具和全新视角。
研究方法
1、样本处理：小鼠卵母细胞体外成熟至第一次减数分裂MII期。采用开放式拉管法（OPS） 进行玻璃化冷冻，并在平衡液和冷冻液中设置不同浓度（0, 25, 50, 100 μmol/L）的亚精胺实验组。
2、发育能力评估：复苏后评估卵母细胞形态学存活率，并进行体外受精统计卵裂率和囊胚率。
3、细胞生理与结构检测：
氧化应激：检测细胞内活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）水平。
线粒体功能：评估线粒体膜电位（JC-1）、ATP水平、线粒体ROS及线粒体分布。
细胞器结构：检测内质网分布和纺锤体形态。
钙离子稳态：检测总细胞内钙和线粒体特异性钙离子水平。
样本：新鲜体外成熟（Con_Invitro）、新鲜体内成熟（Con_Invivo）、玻璃化冷冻（Vit）和补充亚精胺冷冻（Vit+Spd）四组MII期卵母细胞样本，每组3个重复。
Smart-seq2测序分析：通过GO、KEGG和基因集富集分析（GSEA）挖掘差异表达基因（DEGs）的功能和通路，并进行蛋白-蛋白互作网络（PPI）分析鉴定关键基因。
关键结果
（1）补充亚精胺对转录组图谱的作用
为深入解析亚精胺改善冷冻卵母细胞质量的分子机制，研究采用Smart-seq2技术对新鲜体外成熟（Con_Invitro）、新鲜体内成熟（Con_Invivo）、玻璃化冷冻（Vit）和补充亚精胺冷冻（Vit+Spd）的四组MII期卵母细胞样本进行高通量转录组分析。
主成分分析（PCA）和分层聚类结果显示，各组内重复样本聚集良好，组间分散明显。特别值得注意的是，Vit+Spd组转录谱相较于Vit组，更接近于Con_Invitro组（图1A）。分层聚类分析表现出类似分组模式（图1B），各组内相关性均大于95%（图1C），表明数据质量可靠。差异表达基因分析显示（图1D，图2），与新鲜对照组相比，Vit组有623个DEGs（336个上调，287个下调）。而Vit+Spd组中，DEGs减少至353个（185个上调，168个下调），表明亚精胺挽救了约43.3%因冷冻导致的异常表达基因。火山图清晰展示各比较组的基因表达差异模式（图2A-F），充分证明Smart-seq2技术在单细胞水平检测珍稀样本基因表达变化的能力，为解析亚精胺的分子调控网络提供了精细转录组图谱。
图1：玻璃化冷冻前后的差异表达基因
图2：Con_Invitro组、Con_Invivo组、Vit组和Vit+Spd组的DEGs分析火山图。
（2）差异表达基因的富集分析
基于Smart-seq2获得的转录组数据，研究对所有差异基因进行聚类和功能富集分析。热图聚类将所有DEGs分为4类（图3A-B）：Group 1为Con_Invivo特异性高表达群，主要参与染色质组织、RNA聚合酶II转录调控等；Group 2为在Vit组中表达显著降低且不受亚精胺挽救，主要参与DNA损伤应答、mRNA加工和DNA修复；Group 3为亚精胺成功挽救的差异基因亚群，功能参与RNA聚合酶II转录调控、脂肪酸代谢、跨膜转运和蛋白去磷酸化等关键生物学过程；Group 4为高表达且无法被亚精胺挽救的基因亚群，主要参与蛋白转运、蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白分解。
KEGG富集分析（图3D）显示，Con_Invitro组与Vit组的DEGs主要富集于代谢通路、癌症通路、病毒致癌、细胞核质转运等；Con_Invivo组与Vit组的DEGs主要富集于肌动蛋白细胞骨架调控、内吞作用、细胞周期、线粒体自噬等；而Vit 组与Vit_Spd组的DEGs显著富集于神经退行性变、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路和磷脂酶D信号通路。PPI分析鉴定出5个关键枢纽基因（HUB genes）：THOC2、SRSF3、SRSF2、RBBP7和SRRM1（图3C）。
GSEA分析脊线图和富集评分折线图（图4A-F）进一步揭示，Con_Invitro组与Vit组Top 20通路中多数呈下调趋势，尤其卵巢类固醇生成、RIG-I样受体信号通路等；Con_Invivo组与Vit组则表现出广泛上调；重要的是，Vit vs Vit_Spd比较显示亚精胺挽救了约47.3%的异常通路，与基因挽救比例高度一致。这些基于Smart-seq2数据的深度挖掘，不仅系统绘制冷冻损伤的分子图谱，更精准定位亚精胺的核心调控靶点。
图3：Smart-seq2的热图、GO和KEGG分析。
图4：Smart-seq2的GSEA分析
结论和启示
本研究证实，在玻璃化冷冻过程中补充50 μmol/L亚精胺可显著提高小鼠卵母细胞的冷冻后存活率和发育能力。通过Smart-seq2单细胞转录组测序技术，系统揭示了亚精胺通过挽救43.3%的异常表达基因和47.3%的异常通路，从转录组水平重塑了卵母细胞的分子网络。进一步的细胞生物学研究证实，亚精胺通过减轻氧化应激、恢复线粒体功能（改善分布、膜电位和ATP水平）、保护内质网结构、调节钙稳态等多维度机制，全面缓解冷冻诱导的细胞损伤。这些发现不仅为优化玻璃化冷冻技术提供新思路，也为提高卵母细胞冷冻后的存活和发育能力提供潜在的干预策略。
关于易基因单细胞转录组测序（smart-seq2）
10X Genomics公司Chromium解决方案无法满足某些特殊或者微量细胞样本甚至单细胞转录组研究。Smart-seq2技术在单细胞水平对带Poly（A）的RNA进行全长转录组扩增及高通量测序，能够满足高灵敏度、低偏好性的cDNA扩增，得到全长转录本，实现高水平的序列模板转换。
Smart-seq2技术有较好的覆盖范围，可检测到稀有转录本，无需额外的专业设备，应用范围较广，可以解决传统 RNA 定量技术在早期胚胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在的样品量极低或细胞异质性的问题，是在单细胞水平研究基因表达强有力的工具，极大地拓展了RNA-seq 的应用范围。
技术优势：
（1）起始量低：1-1000个细胞或10pg-10ng total RNA即可高效扩增；
（2）转录本覆盖度高：通过双端引物扩增全长cDNA，获得全转录组信息，避免3’端和5’端偏好性，产物完整性好；
（3）检测灵敏度高：大幅度增加了低表达基因的检出量;
（4）碱基分辨率高：可达单碱基分辨率，且可以定位到具体基因的具体转录本;
（5）实验可控：质控点多，可从实验的开端判断细胞状况。
研究方向：
可应用于细胞分子机制中细胞异质性研究，解决因样本量少而无法进行高通量测序的情况。
l 免疫学研究
l 肿瘤及微环境研究
l 绘制组织精细化表达图谱
l 早期胚胎发育
参考文献：Wang L, Li W, Liu Y, Dilixiati A, Chang Z, Liang Y, Wang Y, Ma X, Tang L, He Z, Zhang Y, Wang X. Spermidine Supplementation Effectively Improves the Quality of Mouse Oocytes After Vitrification Freezing. Antioxidants (Basel). 2025 Feb 16;14(2) doi: 10.3390/antiox14020224.
