大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

近日，吉林大学李祥锐博士等为第一作者，李占军教授为通讯作者，在《Advanced Science》期刊发表题为“Site-Specific Mitochondrial RNA N1-Methyladenosine Demethylation via an Engineered MTS-PUF-ALKBH3 Fusion Protein”的科研成果，研究开发了一种不依赖CRISPR的线粒体RNA m¹A去甲基化编辑器（Mitochondrial RNA m¹A Demethylation editor, MRD），通过融合线粒体靶向序列（MTS）、可编辑PUF RNA结合结构域和m¹A去甲基化酶ALKBH3，实现了不依赖于CRISPR的位点特异性线粒体m¹A修饰的精准去甲基化。

具体而言，该研究利用m¹A甲基化RNA免疫沉淀测序（m¹A MeRIP-seq）等前沿技术，在细胞和小鼠模型中验证了MRD的靶向去甲基化效率和脱靶效应，并系统评估了位点特异性m¹A甲基化修饰变化对线粒体功能的影响。更关键的是，研究通过构建转基因小鼠模型，首次在体内证实线粒体tRNA-Lys^A9位点的m¹A去甲基化可导致严重免疫缺陷表型，为线粒体表观转录组学研究和相关疾病治疗提供了新工具和新见解。易基因科技为本研究提供m¹A MeRIP-seq技术服务，助力揭示编辑MTS-PUF-ALKBH3融合蛋白可实现位点特异性线粒体RNA m¹A去甲基化。

英文标题：Site-Specific Mitochondrial RNA N1-Methyladenosine Demethylation via an Engineered MTS-PUF-ALKBH3 Fusion Protein

译文标题：编辑MTS-PUF-ALKBH3融合蛋白可实现位点特异性线粒体RNA m¹A去甲基化

发表时间：2025年10月27日

发表期刊：Advanced Science

影响因子：IF14.1/Q1

技术平台：m¹A MeRIP-seq

作者单位：吉林大学

DOI:10.1002/advs.202510482

线粒体RNA N1-甲基腺苷（m¹A）是一种广泛存在且可逆的表观转录组修饰。尽管对胞质m¹A修饰的生物学作用已逐渐明确，但位点特异性线粒体m¹A甲基化与表型结果之间的因果关系仍未阐明且部分归因于缺乏精确的编辑工具。本研究开发的线粒体RNA m¹A去甲基化（MRD）编辑器在多个位点进行独立细胞实验证实能够精确介导线粒体mRNA和tRNA中的m¹A去甲基化，从而导致线粒体蛋白水平发生相应变化，且脱靶效应极小。此外，研究进一步利用MRD编辑器系统地研究了位点特异性线粒体m¹A甲基化变化在调控细胞增殖、ATP产生、线粒体膜电位（MMP）和线粒体呼吸功能上的关键作用。最后，MRD编辑器的体内应用结果揭示，线粒体tRNA-Lys（MT-TK9）A9位点的m¹A去甲基化会诱导小鼠出现严重免疫缺陷表型。上述成果确立了MRD编辑器为位点特异性线粒体RNA m¹A编辑提供了高效灵活的多功能工具，也为从化学生物学解析这些修饰的功能提供了新见解。

易小结

本研究突破了CRISPR系统难以编辑线粒体RNA的技术瓶颈，开创线粒体RNA修饰精准编辑新思路，实现在体内外对线粒体mRNA和tRNA上特异性m¹A位点的可编程编辑，将线粒体表观转录组学研究从“观察关联”转向“因果验证”新阶段。

易基因金牌技术m¹A MeRIP-seq技术在本研究中的成功应用，在全转录组水平上精准绘制并验证了MRD编辑器的靶向效率与脱靶效应，为工具的可靠性和后续机制解析提供了关键数据支撑，为未来类似研究提供可复制的方法学参考。

研究方法

（1）分子构建：将线粒体靶向序列（MTS）、可编辑PUF RNA结合域和人ALKBH3去甲基化酶融合，构建MRD编辑器及其对照质粒。

（2）细胞模型：HEK-293T和HepG2细胞瞬时转染或慢病毒稳定感染建立表达MRD细胞系。

（3）m¹A检测：

—   RT-1306检测：利用进化型HIV逆转录酶在m¹A位点诱导A→T突变，通过Hi-TOM测序分析突变率定量m¹A水平。

—   SELECT检测：基于单碱基延伸和连接反应的qPCR定量检测低丰度m¹A位点。

—   m¹A -RIP-qPCR：使用抗m¹A抗体进行RNA免疫沉淀结合qPCR定量检测特定转录本上的m¹A富集情况。

—   m¹A MeRIP-seq：使用抗m¹A抗体对片段化RNA进行免疫沉淀，构建测序文库并进行全转录组m¹A修饰谱测序分析，用于评估MRD编辑器的全基因组脱靶效应。

（4）功能表型分析：细胞增殖、ATP水平、线粒体膜电位（MMP）、氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）以评估线粒体呼吸功能。

（5）Western Blot：检测ND5、COX1等线粒体编码蛋白表达水平。

（6）动物模型：

—   组成型表达模型：将靶向小鼠mt-tRNA-Lys^A9位点的MRD表达框通过显微注射整合到小鼠基因组中，获得TK9-MRD转基因小鼠。

—   诱导型表达模型：构建由Tet-On系统（rtTA-TRE3G启动子）调控的TK9-MRD编辑器，获得TK9-DIP-MRD小鼠，通过饮水或腹腔注射Dox诱导编辑器表达。

（7）转录组测序：对小鼠心脏组织RNA进行RNA-seq，通过GO、GSEA和KEGG富集分析差异表达基因和通路。

结果图形

（1）MRD对线粒体mRNA的去甲基化作用

研究团队首先验证了MRD编辑器在线粒体mRNA上的靶向去甲基化能力，选择已知的ND5 mRNA A13743位点和COX1 mRNA A7375位点作为靶标，通过编辑PUF结构域特异性识别这些位点。在HEK-293T细胞中，采用三种独立方法评估m¹A水平：RT-1306检测显示突变率显著降低，SELECT和m¹A-RIP-qPCR均证实m¹A丰度显著下降（图1B-C）。值得注意的是，m¹A MeRIP-seq分析显示ND5-MRD组在A13743位点出现特异性m¹A信号降低，而对照组（NT-MRD和ND5-dMRD）保持高水平修饰（图3A），从转录组水平证实了靶向效率。蛋白水平检测显示，ND5去甲基化后蛋白表达上调（图1D），而COX1去甲基化后蛋白表达下调（图1E），研究还发现MRD平台具有灵活的编辑窗口。上述这些效应在HepG2细胞中得到重复验证，表明MRD编辑器的跨细胞系适用性。同时，共聚焦成像显示MRD编辑器与线粒体标记物高度共定位，证实其成功定位至线粒体（图1F）。

图1：在HEK-293T细胞线粒体mRNA中MRD编辑器的质粒构建与验证

（2）MRD对线粒体tRNA的去甲基化作用

鉴于线粒体tRNA（mt-tRNA）对蛋白质合成的关键作用，研究团队进一步探索MRD在mt-tRNA上的编辑能力。选择mt-tRNA-Lys的两个高丰度m¹A修饰位点：A9（MT-TK9）和A58（MT-TK58）。在HEK-293T细胞中表达相应的MRD编辑器后，RT-1306和SELECT实验结果显示，靶向MT-TK9和MT-TK58的MRD编辑器均能显著降低相应位点的m¹A水平（图2C、F）。功能分析揭示，MT-TK9位点去甲基化导致富含赖氨酸密码子的ND5蛋白水平下降（图2D），而MT-TK58位点去甲基化则导致ND5蛋白水平升高（图2G）。这一相反效应可能反映了不同位点m¹A修饰对tRNA结构稳定性和密码子识别能力的差异化影响。这些结果在HepG2细胞中也得到证实，表明MRD能够有效编辑线粒体tRNA并影响线粒体蛋白翻译。

图2：在HEK-293T细胞线粒体tRNA中验证MRD编辑器

（3）MRD编辑器的脱靶效应评估

为全面评估MRD编辑器的特异性，研究团队对转染靶向ND5 A13743的MRD编辑器HEK-293T细胞进行m¹A MeRIP-seq分析。测序结果显示，与去甲基化酶失活对照（dMRD）相比，MRD处理组在仅在ND5转录本上的m¹A信号特异性降低，证实器高效的靶向编辑作用（图3A）。在全转录组检测到的＞12,900个m¹A位点中，MRD仅导致约1000个位点（~7%）变化，表明其脱靶效应非常有限（图3B）。火山图和Venn图分析显示，ND5-MRD与ND5-dMRD、ND5-MRD与NT-MRD、ND5-dMRD与NT-MRD三组间的差异m¹A位点重叠度低，进一步证明编辑的精准性。靶向MT-TK9位点的MRD编辑器也表现出类似的低脱靶效应。

m¹A MeRIP-seq在上述研究研究中提供了全基因组范围的m¹A修饰图谱，并定量评估编辑器的脱靶效应。该技术不仅验证了MRD的高准确率，还为后续优化编辑效率提供了数据基础。

图3：MRD编辑的脱靶评估

（4）m¹A变化通过MRD编辑器改变细胞生长和线粒体功能

基于上述发现，研究团队系统评估了位点特异性m¹A去甲基化对细胞表型的影响。瞬时转染实验显示ND5靶向MRD对短期增殖无显著影响，但考虑到m¹A动态调控特性，研究采用慢病毒系统构建了稳定表达细胞系。结果显示ND5 A13743、COX1 A7375和MT-TK9位点去甲基化均导致细胞生长停滞（图4C、F、I），而MT-TK58位点去甲基化促进细胞增殖（图4L）。线粒体功能分析揭示ND5和COX1位点去甲基化降低ATP合成（图4D、G），而两个tRNA位点去甲基化均增强ATP产生（图4J、M）。线粒体膜电位（MMP）检测显示ND5 A13743和MT-TK9去甲基化降低MMP（图4E、K），而COX1 A7375和MT-TK58去甲基化升高MMP（图4H、N）。上述分析结果证明，线粒体RNA上特定位点的m¹A修饰以位点特异性的方式精细调控细胞增殖、能量代谢和线粒体功能。

图4：MRD编辑器通过靶向m¹A修饰改变细胞表型

（5）线粒体tRNA-Lys^A9位点的m¹A去甲基化可能诱导小鼠严重免疫缺陷

为验证MRD的体内应用潜力，研究利用SB转座子系统构建了组成型表达靶向具有最高丰度m¹A修饰的mt-tRNA-Lys^A9位点MRD编辑器（TK9-MRD）转基因小鼠（F0代）。PCR验证显示5只新生鼠中2只携带转基因，其中一只出生后即死亡，表现为体型小和紫绀；另一只存活至成年并与野生型交配获得F1代。意外的是，F1代TK9-MRD小鼠在出生后两周内死亡率极高（图5B）。

多组织RT-1306和SELECT检测证实TK9-MRD小鼠mus-TK9位点m¹A水平显著降低（图5C、D）；Western blot显示心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肌肉组织中ND5蛋白表达显著下调（图5E）。心脏组织RNA-seq分析结合GO-GSEA富集分析显示，先天免疫应答相关基因显著富集，KEGG分析提示多种感染相关疾病通路激活（图5F、G）。值得注意的是，T细胞和B细胞受体信号通路未富集，提示适应性免疫未激活，与先天免疫过度激活形成对比。造血细胞谱系通路显著富集，IL-7、CD8等基因上调，表明造血干细胞向淋巴细胞分化受阻（图5H）。脾脏HE染色显示白髓淋巴细胞、造血和单核细胞减少，红白髓边界模糊（图5I），证实免疫缺陷表型。上述研究结果表明，线粒体tRNA-Lys^A9位点m¹A修饰对适应性免疫系统的发育至关重要，其缺失导致免疫缺陷和高死亡率。

图5：小鼠线粒体tRNA-Lys^A9位点的m¹A去甲基化

（6）多西环素诱导的小鼠线粒体tRNA-Lys^A9位点m¹A去甲基化

为排除转座元件随机整合导致的非特异性效应，研究团队构建了多西环素（Dox）诱导表达的TK9-DIP-MRD小鼠模型。该模型在未给予多西环素（Dox）时，TK9-MRD表达受抑，F1代小鼠存活率与野生型相当（图6B），证明随机整合本身不导致致死表型。给予Dox诱导表达4周后，多组织检测显示RT-1306和SELECT证实mus-TK9位点m¹A水平显著降低（图6C-D）；Western blot显示ND5蛋白表达下调（图6E）；脾脏病理学检查显示与组成型TK9-MRD小鼠相似的异常（图6F）。这些结果确证了MRD诱导的m¹A低甲基化是免疫缺陷和多器官病理改变的主要原因，而非转座元件整合的副产物。

图6：多西环素诱导的小鼠线粒体tRNA-Lys^A9位点m¹A去甲基化

结论和启示

本研究成功开发了MRD平台，实现了线粒体RNA m¹A甲基化的位点特异性编辑，为线粒体表观转录组学研究提供了突破性工具。

—   MRD可在细胞和整体动物水平高效、特异性位点的m¹A去甲基化；

—   线粒体mRNA和tRNA上的m¹A修饰对蛋白质合成、细胞增殖和能量代谢具有位点特异性调控作用；

—   mt-tRNA-Lys^A9位点m¹A是适应性免疫系统发育的关键调控因子，其缺失导致严重免疫缺陷和多器官功能障碍。

该研究不仅深化对RNA修饰的生物学功能相关理解，更展示了靶向RNA修饰在疾病治疗中的潜力。m¹A MeRIP-seq等高通量测序技术的应用，为精准解析RNA修饰的动态变化和功能提供了技术参考，未来在优化编辑工具、筛选治疗靶点和评估干预效果方面将发挥越来越重要的作用。

参考文献：Li X, Kong D, Liu H, Yang J, Zhou J, Qian Y, Zhao D, Li J, Wu X, Zhang T, Sun X, Han Y, Lai L, Li Z. Site-Specific Mitochondrial RNA N1-Methyladenosine Demethylation via an Engineered MTS-PUF-ALKBH3 Fusion Protein. Adv Sci (Weinh). 2025 Oct 27:e10482. doi: 10.1002/advs.202510482.