微量cfDNA简化基因组甲基化测序（cfDNA-RBS）
cfDNA片段化严重，片段大小常在150bp左右，现有甲基化检测技术包括cfMeDIP和微量WGBS等。无法做到碱基分辨、具有抗体特异性和非特异性捕获、覆盖深度低、检测成本高等特点。常规RRBS富集约70-350bp范围酶切片段，如对于CG含量高的片段将被切割的更碎而无法检测，保留下来的片段反而是CG含量低，无甲基化信息的基因片段。
易基因研发cfDNA-RBS技术，特异性捕获CCGG位点两端的DNA，通过亚硫酸盐测序，实现高深度，单碱基分辨检测CG位点甲基化信息。DNA起始量仅需5ng，是目前肿瘤甲基化标志物检测研究的优选技术，应用场景包括肿瘤早筛、肿瘤诊断、个性化用药、实时监控、预后监测等。
技术优势：
1、超低起始量：100-500ul血浆或5ng cfDNA；
2、测序覆盖度高：20G测序数据，可达10M的CG位点覆盖，涵盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点等多种核心调控区域
3、单碱基分辨率：在其覆盖范围内可精确分析每一个C碱基的甲基化状态；
4、性价比高：成本相对于现有技术大幅降低。
应用场景：
1、癌前病变的癌变预警标志物检测
2、肿瘤早期筛查标志物检测
3、肿瘤预后标志物检测
4、药物疗效预测标志物检测
技术路线：
实验策略：
分析内容：
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cfDNA-RBS |
分析内容 |
解决问题 |
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标准分析 |
测序数据质量评估 |
过滤掉低质量数据，保证数据质量 |
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参考基因组比对分析 |
比对率和覆盖度分析 |
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MSPI酶切效率及Bisulfite转化率质控 |
MSPI酶切效率＞95%；Bisulfite转化率＞99% |
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甲基化位点 calling |
分析胞嘧啶甲基化位点 |
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甲基化分布图谱 |
甲基化在基因组及功能元件上的分布 |
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组间差异甲基化DMR分析 |
寻找 DMR及注释 |
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差异甲基化基因DMG分析 |
相关基因 GO，KEGG 富集分析 |
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多样本聚类分析 |
PCA 分析多样本甲基化变化规律 |
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个性化分析、多组学关联分析请联系对接销售或技术支持 |
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送样要求：
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送样要求 |
项目周期 |
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1、样本类型：血浆，尿液，脑脊液等cfDNA提取样品 2、样本收集：采用含固定剂的专用 cfDNA收集管（10ml），以稳定cfDNA，4℃低温保存，48h内分离血浆，-80℃长期储存。 3、样本总量：100-500ul血浆或1ng cfDNA 4、推荐数据量： 20G raw data |
35个工作日。 |
技术指标：
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技术参数 |
cfMeDIP |
cfDNA-WGBS |
cfDNA-RBS |
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原理 |
抗体捕获 |
全片段测序 |
CCGG片段 |
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样本要求 |
5ng |
10ng |
5ng |
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测序数据量 |
10G |
90G |
20G |
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测序深度 |
NA |
10X |
30X |
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分辨率 |
300-600bp |
单碱基 |
单碱基 |
cfDNA提取及检测效果
a. 提取样本为比较纯的cfDNA，主带在150bp左右；
b. 提取样本中含有较多gDNA污染
经典案例
全基因组cfDNA甲基化分析提高了早期乳腺癌无创诊断成像的准确性
Liu J,et al.Genome-wide cell-free DNA methylation analyses improve accuracy of non-invasive diagnostic imaging for early-stage breast cancer. Mol Cancer. 2021 Feb 19;20(1):36.
背景
基于乳房X线片和超声技术的乳腺影像报告和数据系统(BI-RADS)被广泛用于乳腺癌的早期诊断，但这种方法的假阳性率较高，会导致不必要的活检，尤其是对于BI-RADS-4类的患者来说。而携带DNA甲基化信息的游离DNA(cfDNA)已经成为一种非侵入性的癌症检测方法。
方法
本研究收集了接受乳腺X线片和超声检查后活检的210例BI-RADS 4类乳腺病变女性患者。从CHCAMS的活检患者中收集了20个肿瘤样本(10个恶性和10个良性)，用于全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)。
结论
基于血液的全基因组DNA甲基化研究，以单碱基分辨率从良性肿瘤中检测早期乳腺癌，结果表明结合液体活检和传统的成像诊断可以通过降低假阳性率和避免不必要的损害来改进当前乳腺癌早期诊断的临床实践。
图：液体活检与传统的诊断显像相结合可以提高早期乳腺癌诊断的准确性。
参考文献：Liu J,et al.Genome-wide cell-free DNA methylation analyses improve accuracy of non-invasive diagnostic imaging for early-stage breast cancer. Mol Cancer. 2021 Feb 19;20(1):36.
