单细胞甲基化+转录组测序(scBS+RNA-seq)

单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库技术。传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了一系列微量及单细胞甲基化检测方法,可对于不同项目需求,个性化提供检测方案,在全基因组、简化基因组、靶基因等范围开展甲基化检测。


易基因建立的单细胞及微量样本DNA甲基化测序技术包括:

1、单细胞全基因组甲基化测序(scWGBS)

2、单细胞简化基因组甲基化测序(scXRBS)

3、微量样本全基因组甲基化测序(Micro DNA-WGBS)

4、微量细胞或DNA简化基因组甲基化测序(Micro DNA-XRBS)


应用方向:

单细胞及微量珍稀样本的甲基化研究主要应用于肿瘤发生机制,癌症研究,胚胎植入前诊断,胚胎早期发育,生殖细胞重组,干细胞及细胞异质性等研究领域。应用的样本包括单细胞、微量细胞、微量DNA等。特别适用于难以取得的珍稀样本和细胞异质性较大的组织样本。


技术优势:

1)微量细胞或单细胞全基因组甲基化测序(Micro DNA-WGBS)DNA起始量:

     单细胞/100-1000个细胞

     1ng基因组DNA

     90%以上基因组CG覆盖


2)微量细胞或DNA简化基因组甲基化测序(Micro DNA-XRBS)DNA起始量:

     1ng基因组DNA;

     10-20M有效CG位点覆盖;

     20G测序数据量。

技术路线:


实验策略:


分析内容:

技术名称

标准分析内容

scWGBS/Micro DNA-WGBS

测序数据质量评估

1、转化效率评估;

2、原始下机数据质控;

3、比对质量评估;

4、测序深度和覆盖度评估

全基因组甲基化水平分析:

1、全基因组甲基化水平概览;

2、各样本全基因组甲基化图谱展示;

3、甲基化平均水平统计;

4、全基因组甲基化的分布;

5、各样本甲基化水平分布比较;

6、各基因元件的甲基化水平特征;

7、基于全基因组甲基化图谱的分层聚类;

8、基于全基因组甲基化图谱的主成分分析;

差异甲基化区域(DMR)的鉴定及统计

1、差异甲基化区域(DMR)的鉴定;

2、DMR的基本统计;

3、DMR所修饰基因的注释;

4、DMR修饰基因的统计;

5、DMR在染色体上的分布。

6、DMR在基因元件上的分布;

7、DMR所修饰基因的功能富集分析

Micro DNA-XRBS

测序数据质控和统计:

1、数据产出与质控;

2、C碱基有效测序深度的累积分布和覆盖度

样品整体甲基化水平:

1、全基因组甲基化水平;

2、全基因组 C 碱基的平均甲基化水平;

3、全基因组三种类型甲基化位点的比例分布;

4、染色体水平的甲基化和 C 碱基密度分布;

5、甲基化 C 位点附近的 9bp 序列的序列特征分析;

6、分析CpG island 及其周边区域的甲基化水平分布规律

不同组别样本的甲基化差异:

1、CpG 甲基化相关性分析(PCC);

2、CpG 甲基化主成分分析(PCA);

3、CpG 甲基化聚类分析(Clustering)

差异甲基化区域(DMR)分析:

1、差异甲基化区域(DMR)检测;

2、差异甲基化区域(DMR)的注释;

3、差异性甲基化基因(DMG)的功能分析;

4、差异性甲基化区域(DMR)的可视化

注:个性化分析、多组学关联分析请联系对接销售或技术支持



送样要求:

送样要求

项目周期

1、样本要求:>1ng的基因组DNA或微量细胞,或单细胞

2、DNA纯度:OD260/280=1.8-2.0

3、测序深度:≥ 30X

35个工作日


技术指标:

技术类型

起始量

特点

覆盖度

常规WGBS

1μg gDNA

正常BS建库技术

95%

Micro DNA-WGBS

1-10000个细胞/1ng基因组DNA

在常规WGBS技术上进行技术改进,使得起始量大大降低,适合珍稀样本的研究

95%

scWGBS

单细胞/1-10个细胞

克服了组织内部细胞异质性的影响,可以满足单个细胞层面的课题研究

20%

Micro DNA-xRBS

1ng gDNA、单细胞

为Micro DNA-WGBS的简化版本,特别适用于大样本量的珍稀样本DNA甲基化研究

20M CG



不同DNA甲基化检测技术特点:



1、WGBS和RRBS用于基因组范围内研究探索,并筛选目标基因(候选DNA甲基化标记物);

2、Target-BS(TBS)用于后续目标基因的甲基化验证


经典案例

动物研究(项目文章):

微量细胞样本Micro DNA-WGBS绘制猴子植入前胚胎发育中的DNA甲基化图谱

Gao F, et al. De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Res. 2017 Apr;27(4):526-539. pii: cr201725.


1.背景:

可能由于技术上的限制,还没有研究揭示早期胚胎发育过程中的全基因组DNA再甲基化。


2.方法:

利用具有超低DNA起始量(100个细胞)的微量细胞全基因组DNA甲基化测序技术(Micro DNA-WGBS)绘制灵长类动物(恒河猴,Macaca mulatta)植入前胚胎发育的全基因组甲基化图谱。


3.结论:

本研究使用Micro DNA-WGBS对猴子早期胚胎发育过程的5mC进行单碱基分辨率、高覆盖率的甲基化分析。分析结果鉴定了发育过程中的全基因组DNA去甲基化和从头甲基化,特别是在从2细胞到8细胞阶段的过渡期间,研究首次全面阐明了DNA甲基化动力学的“兴衰”。此外,DNA甲基转移酶敲降实验表明,异常的DNA甲基化会影响灵长类动物早期胚胎的正常发育。本研究结果进一步完善了目前关于哺乳动物DNA甲基化重编程的知识体系,并为未来灵长类动物胚胎发育的研究提供了宝贵的数据资源。



成对比较揭示植入前胚胎发育过程中全基因组DNA去甲基化和从头甲基化



人类研究:

人类植入前胚胎发育的单细胞DNA甲基化组图谱

Zhu, P., et al. (2018).Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos.Nat Genet 50(1)


1、背景:

在哺乳动物基因组上,胞嘧啶(主要是CpG二连体中的胞嘧啶)在DNA甲基化酶的催化下会发生甲基化。研究显示,DNA甲基化对多个生物学过程都至关重要,如基因表达抑制、转座子转录活性调节、X染色体的失活,以及基因组印记的维持等。此前研究显示在着床前的早期胚胎发育过程中只有大规模的DNA去甲基化。而此次研究数据显示,精子和卵细胞结合受精之后,在人类早期胚胎大规模DNA去甲基化的同时,也在大量高度特异的DNA从头加甲基化,这表明在人类早期胚胎第一轮DNA甲基化组重编程过程中,全局的DNA去甲基化‘净结果’实际上是高度有序的大规模DNA去甲基化和局部DNA加甲基化两种分子过程相互拮抗产生的动态平衡的结果。


2、方法:

利用单细胞DNA甲基化组高通量测序方法,首次在单细胞分辨率对人类植入前胚胎发育过程进行了更加深入的分析

3、结论:

在这篇文章中,为了进一步在单细胞水平研究DNA甲基化重编程过程的动态特征,利用单细胞全基因组DNA甲基化组高通量测序技术,对人类植入前胚胎发育的各个关键阶段进行了单细胞、单碱基分辨率的系统研究,主要发现有:

(1)首次发现了人类植入前胚胎发育过程中存在大量特异性的DNA从头加甲基。

(2)首次发现从二细胞胚胎阶段开始父母本基因组上的剩余甲基化水平发生逆转,在同一个单细胞中母本基因组上的剩余甲基化水平显著高于父本基因组上的剩余甲基化水平。

(3)首次发现DNA甲基化在早期胚胎卵裂过程中的不对称分配可以用来追溯同一个胚胎中每个细胞的遗传谱系。



图:植入前胚胎不同发育阶段DNA甲基化的动态变化


参考文献:

1、Gao F, et al. De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Res. 2017 Apr;27(4):526-539. pii: cr201725.

2、Zhu, P., et al. (2018).Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos.Nat Genet 50(1).